三种蠕形螨组织化学、酶组织化学及山羊蠕形螨酶学、分子生物学研究

发布时间：2018-10-22 12:13

【摘要】： 目的人体蠕形螨(human Demodex)寄生于人毛囊、皮脂腺内,可引起痤疮、毛囊炎、酒渣鼻、睑缘炎、脱发等症。山羊蠕形螨(Demodex caprae)能引起羊皮皮脂腺囊肿,致使板皮穿孔,给畜牧业造成巨大经济损失。目前有关蠕形螨的流行病学及治疗药物的研究较多,而其超微结构、组织化学、致病机理及分子生物学方面的研究因技术瓶颈的限制进展困难。本实验在探索活蠕标本显微处理技术的基础上,建立蠕形螨整体染色法,应用组织化学技术、酶组织化学技术观察两种人体蠕形螨和山羊蠕形螨的形态、内部结构、化学成分、酶及其在体内的分布。应用酶学方法测定山羊蠕形螨体内酯酶及蛋白酶的活性。经方法改良,提取山羊蠕形螨基因组DNA。目的是为今后从染色法、酶学、分子生物学角度研究蠕形螨的结构、生理、分类和致病机理铺平道路。方法用自制刮片加压刮取人额部皮脂;切开新鲜山羊皮下结节取出其中干酪样物;将标本充分浸没于洗涤剂中,在解剖镜直视下,用自制挑螨针将螨从皮脂中分离并反复清洗干净。将洁净活蠕分类置于超纯水中,于-20℃冷冻48小时后,采用自创的蠕形螨整体染色技术染色:用Giemsa染料染色显示内部结构,碘液染色显示糖原,油溶红O染色显示脂类,甲基绿染色显示DNA。采用Gomori法对酸性磷酸酶、碱性磷酸酶进行染色,采用Gomori醋酸-α-萘酯法对酯酶进行染色,采用Tween法对脂肪酶进行染色。在解剖显微镜直视下,将洁净新鲜的山羊蠕形螨置于自制冰冷微型研钵中研磨粉碎,冷冻离心,取上清液为酶源。参照Asperene的方法,以醋酸-α-萘酯为底物,固蓝B盐为显色剂,在600nm波长下测吸光度来测定山羊蠕形螨酯酶活性;制作1‰明胶、1%琼脂平板,打孔,在孔中滴加50μl酶源,30℃作用4小时后考马斯亮蓝R250染色检测山羊蠕形螨蛋白酶活性。用改进法提取山羊蠕形螨的基因组DNA,以琼脂糖电泳及紫外分光光度计进行检测。结果经过组织化学染色后,三种蠕形螨内部结构、糖原、酯类及DNA着色。经过酶组织化学染色,三种蠕形螨体内酸性磷酸酶、脂肪酶所在部位被染成棕黑色,碱性磷酸酶所在部位被染成黑色,酯酶所在部位被染成紫红色。Asperene法测酯酶活性,酶源组吸光度为0.205±0.027,阴性对照组吸光度为0.090±0.008,两组间有显著差异(P＜0.01)。以明胶平板法测定山羊蠕形螨蛋白酶活性,考马斯亮蓝R250染色后酶源所在孔周围形成透明环,说明酶源中含有能消化明胶的蛋白酶。用改进的方法,成功用5000条山羊蠕形螨提取出基因组DNA,琼脂糖电泳显示为一高分子量DNA条带,紫外分光光度计检测OD_(260)/OD_(280)大于1.6。结论自创的蠕形螨整体染色法解决了蠕形螨整体染色显示内部结构的问题。发现三种蠕形螨体内含有大量的糖原、酯类和DNA,具有酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、酯酶和脂肪酶活性。山羊蠕形螨体内酯酶及蛋白酶活性较高。这支持蠕形螨以脂类和角蛋白为食的观点,它可能是一种脂螨。同时酶可能是蠕形螨致病的化学物质。成功提取出高质量的山羊蠕形螨基因组DNA。以上创新性工作为今后从染色法、酶学、分子生物学角度研究蠕形螨的结构、生理、分类和致病机理铺平道路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R184;S852.7

【引证文献】