郑州地区医院病人环孢子虫病流行病学调查及分子遗传特性初步研究

发布时间：2020-02-07 22:42

【摘要】：环孢子虫(Cyclospora)为艾美球虫科(Eimeriidae)环孢子虫属(Cyclospora)成员,在世界范围内流行传播,具广泛宿主。环孢子虫为一种新近发现的肠道寄生原虫,主要寄生于宿主小肠的上皮细胞,可引起宿主食欲减退、体重减轻、持续性腹泻、肠痉挛及其它胃肠炎等临床症状。免疫功能正常者感染环孢子虫后主要引起自限性腹泻,而对于免疫抑制者或免疫功能缺陷者,感染环孢子虫后则可致持续性腹泻甚至死亡。近年来,环孢子虫病受到国内外越来越多研究人员的广泛关注和重视。2008年7月到2010年1月,采用福尔马林-乙酸乙酯沉淀法、饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省郑州地区3家医院的病人进行环孢子虫的感染情况进行调查,共发现环孢子虫感染者29例。用PCR方法对其18Sr RNA基因和ITS-1基因扩增,序列比对结果经系统进化发育分析,所获环孢子虫虫株均属于卡耶塔环孢子虫。 本次试验共调查5285名病人,总感染率为0.5%(29/5825)。其中,河南省人民医院、郑州市儿童医院和郑州大学三附院病人环孢子虫感染率分别为0.5%(22/4836)、0.5%(3/608)和1.0%(4/381);春季、夏季、秋季和冬季环孢子虫感染率分别为0.0%(0/823)、1.0%(21/2017)、0.4%(8/1878)和0.0%(0/567),表明环孢子虫感染与季节具有明显相关性(P0.01);此次调查发现各个年龄段均发现有环孢子虫感染,其中以0~17岁和60岁以上感染率较高,表明环孢子虫感染与年龄具有相关性(P0.05);男性的环孢子虫感染率为0.6%(19/3154),女性的感染率为0.5%(10/2131) ,表明环孢子虫感染与性别无统计学意义(P0.05)。100倍光学显微镜下测量50个环孢子虫卵囊,大小为7.5μm×7.5μm。 基于18S rRNA基因和ITS-1基因对29个环孢子虫阳性样品进行巢式PCR扩增,对扩增出的29个环孢子虫样品的18S rRNA基因和7个环孢子虫样品的ITS-1基因进行测序,拼接比对后的序列通过NCBI、EMBL和DDBJ三大分子生物学数据库搜索同源序列,然后运用Clustal X1.81、Phylip3.64和DNAstar5.0等分子生物学软件对所获得的序列进行比对分析、构建分子进化树。基于18S rRNA基因位点分析,结果表明29个人源环孢子虫样品与C. cayetanensis进化关系最为接近,仅存在两个碱基差异。而根据在ITS-1基因位点种系进化分析,表明同一地理位置的分离株同源性较高。 本研究对河南省郑州地区人源环孢子虫流行状况进行了调查,了解对了人源环孢子虫在河南省的流行情况及特点,并运用分子生物学方法进行了分析,掌握了河南省人源环孢子虫遗传特征及分子特性,为以后人源环孢子虫在全国范围内的研究奠定了基础。
【图文】：

环孢子虫在微分干涉（DIC）显微镜下呈球形，虽有一个清晰的卵囊壁，，但易与其它球形物质混淆，不易辨别。在紫外荧光（UV）显微镜下环孢子虫卵囊壁自发荧光，在330~365nm光谱下环孢子虫显示蓝色光，在450~490nm光谱下环孢子虫显示绿色光(图1-1)。图1-1 微分干涉显微镜紫外荧光显微镜下环孢子虫卵囊Fig 1-1 C. cayetanensis oocysts under DIC and UV microscope5. 2.2 改良抗酸染色法改良抗酸染色法是国际上应用最广泛的C. cayetanensis检测方法。环孢子虫经改良抗算染色法染色后，在蓝绿色背景下，卵囊结构比较明显。卵囊着色从亮粉色到深紫色不等，有一些不着色。卵囊形态差异较大，有的呈圆形，有的卵囊壁向内凹陷或者扭曲变形(图1-2)。

囊染色均一，为红色到红橙色，可以减少误诊率，但该法需使用加热设备进行加热处理。 (图1-3)。图1-2 改良抗酸染色法染色后的环孢子虫卵囊Fig 1-2 C. cayetanensis oocysts stained with modified acid-fast technique.图1-3 番红精染色法染色后的环孢子虫卵囊Fig 1-3 C. cayetanensis oocysts stained with the safranin stain technique5. 2.4 三色染色法三色染色法是大部分实验室常规的粪便检测方法，能检测出环孢子虫卵囊，但卵囊均不着色，不能准确鉴别卵囊。利用该法可检测出环孢子虫卵囊但无法确认，因此，该法可用于疑似含有环孢子虫卵囊的样品。5.3 孢子化实验新鲜粪便样本中的环孢子虫卵囊均未孢子化，内部结构不易观察。将环孢子虫卵囊于2.5％重铬酸钾溶液中，室温下完成孢子化需7~13d，100倍光学显微镜下可见2个孢子囊，每个卵圆形孢子囊含2个子孢子（图1-4）。1997年，Smith[48]等报道环孢子虫孢子化所需温度的范围为22~30℃
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R181.3

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本文编号：2577324