中国南方广西壮族自治区血红蛋白病的分子流行病学调查

发布时间：2020-10-29 09:12

　　 背景与目的 血红蛋白病是一组常染色体隐性遗传病,可分为地中海贫血和异常血红蛋白两类。地中海贫血的特征是珠蛋白肽链的合成减少；异常血红蛋白表现为珠蛋白肽链结构异常。少数的异常血红蛋白,如异常血红蛋白E(Hb E),也可以表现为地中海贫血的血液学表型。另外,遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)通常也被归入“地中海贫血”一类中,这主要是由于它们常常与不同类型的地中海贫血复合遗传,并对后者的表型起修饰作用。做为世界上最常见的单基因遗传病之一,血红蛋白病广泛分布在世界的热带和亚热带地区。在我国,见于长江以南的多个省区。在这些地区,其居高的发病率,已使血红蛋白病所致的溶血性贫血成为严重的公共卫生问题。 广西壮族自治区位于我国与越南北部接壤的西南沿海,是壮族人口在我国的主要聚居地,中国壮族人群中约95%(1538万)的人口居于广西,占广西人口总数的32.7%。已有的研究显示,广西地区血红蛋白病的携带率位居全国之首。但是,整个广西地区及其不同民族中血红蛋白病的流行状况与分子特征,目前尚无彻底系统的研究。 本研究的主要目的是阐明血红蛋白病在广西地区的流行率以及不同基因型地贫共同遗传的方式。我们采用基因型和血液学表型相结合的分析方法,系统分析了来自广西6个地区5789份样本的α-、β-和δ-珠蛋白基因,确定了血红蛋白病在广西地区的携带率和突变谱,并评估了血红蛋白病在广西不同地区与民族中的分布特点。此外,检测过程中,我们首次发现并报道了6例α-或δ-地贫新突变,以及2例在中国首次报道的6-珠蛋白基因突变。 材料与方法 1.人群样本：根据广西地区人口分布及民族构成,共采集了广西6个地区中12所中小学校的5789例广西籍中小学生(男2841,女2948)的外周血样本。汉族、壮族和瑶族样本数的比例分别为58.1%、28.8%和10.7%,其它少数民族样本占总样本数的2.4%。 2.血液学分析：对所有样本进行了血常规和血红蛋白组成分析。根据血液学指标分析结果,进一步筛查标准型α-地贫、β-地贫、δ-地贫和异常血红蛋白的基因型。进行标准型α-地贫分子筛查的血液学指标是：MCV80 fL,MCH27 pg,Hb A23.5%；β-地贫进行分子筛查的血液学指标是：①MCV80 fL, MCH27 pg和Hb A23.5%；②表现出Hb E电泳带；③Hb F5.0%。δ-地贫进行分子筛查的血液学指标是：①Hb A22.0%；②2.0%Hb A24.0%, MCV80 fL,MCH27 pg；异常血红蛋白进行分子筛查的表型指标是：醋酸纤维膜电泳可见异常血红蛋白电泳带。 3.分子分析：用酚／氯仿方法提取基因组DNA。采用Gap-PCR技术、反向点杂交(RDB)技术检测常见α-地贫缺失突变和点突变；采用反向点杂交(RDB)技术检测常见β-地贫点突变；用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测δ-地贫突变。采用多重连接酶探针扩增反应(MLPA)技术或DNA测序技术检测少见及未知的α-和β-珠蛋白基因缺失突变或点突变。所有β-地贫阳性的样本均检测了α-地贫常见点突变和缺失突变。所有δ-地贫阳性的样本均检测了α-地贫常见点突变和缺失突变及β-地贫常见点突变。异常血红蛋白带的所有样品,均按照条带的位置,分别进行了α-、β-和δ-珠蛋白基因链的基因测序分析。采用Real-time PCR技术对新发现的α2珠蛋白基因突变进行功能分析。采用基于PCR的限制性片段长度多态性(RFLP)技术对δ-地贫新突变进行β-珠蛋白基因簇单倍型分析。 4.统计学分析：当前人口和预计将来重型和中间型地贫出生人口的统计源数据来自于“广西壮族自治区计划生育人口通报”。使用统计软件SPSS13.O,采用Pearsonχ2检验的方法比较不同民族和不同地区之间的地贫基因携带率,采用x2分割法将不同民族与地区间地贫携带率进行多重比较。采用两独立样本t检验方法比较新突变基因和正常基因对α-珠蛋白基因mRNA水平的影响。用Hardy-berg平衡公式,计算不同地贫等位基因频率和杂合子频率,判断该调查群体是否处于Hardy-berg平衡。 结果 血红蛋白病的人群发病率 我们采用血液学表型和基因型相结合的分析策略,在5789例样本中共检测出α-、β-或δ-珠蛋白基因突变等位基因1419(24.51%)个,包括α-地贫突变基因1016个(17.55%),β-地贫突变基因372个(6.43%),6-地贫突变9个(0.16%),异常血红蛋白突变基因22个(0.38%)。370例β-地贫携带者中,79例(1.36%)检测到同时携带有α-地贫,表现为29种不同的基因型组合。δ-地贫和异常血红蛋白在广西人群中的携带率较低,但表现出较多种类的基因型。此外,我们在本研究中发现了5种新突变及2种未曾在中国人群中报道过的少见突变。本研究为准确的阐述各种血红蛋白病在广西人群中的发病率,将可致地中海贫血的常见异常血红蛋白,按其突变基因分别归类为α-地贫(Hb Westmead, Hb CS, and Hb QS)或β-地贫(Hb E)。 α-、β-或δ-地贫的突变谱 本研究总结并分析了1016个α-地贫等位基因和372个β-地贫等位基因的分子特点和及在不同民族和地区中的分布规律。在α-和β-地贫基因中,6个最常见的α-地贫突变和8个最常见的β-地贫突变分别占α和β珠蛋白肽链突变的98.9%和98.1%。汉族、壮族及瑶族的α-地贫和β-地贫的突变携带率分别为：15.71%(528／3361)和6.43%(261／3361)、20.12%(336／1670)和7.01%(117／1670)、20.84%(129／619)和5.17%(32／619),统计学分析发现α-地贫在汉族和壮族之间、汉族和瑶族之间的携带率存在显著性差异(p0.0001),而在壮族和瑶族之间没有显著性差异(p0.05)。β-地贫携带率在三个民族之间的没有显著性差异。同时,我们分析了α-和β-地贫的发病率在广西6个地区的分布特点。结果显示,仅百色和贺州两地区的α-地贫突变携带率比其它4个地区的α-地贫突变携带率要高(P0.05),α-地贫突变携带率在其它地区及β-地贫突变携带率在各地区之间均没有显著性差异(P0.05)。因在本研究中,只发现了9例δ-地贫,我们没有在不同民族和地区之间进行比较分析。根据检测的结果,我们认为δ-130(A→G)和-77(T→C)在广西地区应该较为多见。 6种新突变和2种少见突变 本次研究我们发现了1种发生在α2-珠蛋白基因和5种发生在6珠蛋白基因的新突变。检测到的α2-珠蛋白基因新突变为CD13 (GCC→TCC), (HBA2:c.40 G→T, Genbank ID. GU145033),共2例。我们采集其中一个家系,通过反转录实时定量PCR技术分析突变对α-珠蛋白基因mRNA水平的影响。采用内参和靶基因的双标准曲线相对定量的方法,内参采用β-珠蛋白基因。突变组α-珠蛋白mRNA相对含量为0.229±0.103(n=5),正常对照组α-珠蛋白mRNA相对含量为0.162±0.229(n=5)。应用两独立样本的t检验方法进行统计学分析表明,新突变不影响a-珠蛋白基因mRNA水平,因此,该突变应该属于静止型突变或不引起地贫表型的异常血红蛋白突变。 另外5种新突变均发生在δ-珠蛋白基因链上,分别为δ-130 (A→G) (HBD.c-180 A→G, Genbank ID GU145029)、-44 (G→A) (HBD.c-94 G→A, Genbank ID GU145030)、DEL-8～102 (HBD.c-58～52del, Genbank ID GU145032)、CD31 (CTA→TTA), (HBD.c 94 T→C, Genbank ID GU145031)、PolyA+6 (T→G), (HBD.c+136 T→G, Genbank ID GU145034)。我们采集到-130(A→G)、-44(G→A)、DEL-8～102突变家系各1个。采用RFLP技术对其进行β-珠蛋白基因簇单倍型分析,结果显示,-130(A→G)突变连锁单倍型为“+------”,44(G→A)突变连锁单倍型为“-++-+-+”,DEL-8～102突变连锁单倍型为“-------”。 除此之外,两例少见突变也是第一次在中国人群中报道,分别为位于δ-珠蛋白基因启动子的-77 (T→C) (HBD.-127 T→C),和可以形成异常血红蛋白Hb A2-Melbourne的δCD43 (GAG→AAG)。 Hb Westmead的血液学特征 本研究中我们共检测到89例(1.55%) Hb WS突变,其携带率仅次于—SEA、-α3.7和-α4.2,为最常见α-地贫非缺失型突变。89例Hb WS突变样本中,11例(12.36%)合并β-地贫突变,5例合并α-地贫突变。为进一步探讨Hb WS的特征,我们对本研究中的76例Hb WS突变杂合子及62例来自于临床实验室的携带有Hb WS突变的样本依据α-基因型的不同进行分组,然后比较各组之间的血液学参数。比较的结果显示,大部分血液学参数在各组之间均表现出显著性差异(P0.05)。当Hb WS合并—SEA (—SEA/αWSα)时,Hb WS可使地贫的表型加重,表现为Hb H病的特征。且对女性的影响似乎比对男性的影响更明显。 讨论 本研究调查了广西地区血红蛋白病的分子流行病学特征。结果显示,血红蛋白病在该地区的人群携带率高达24.51%,尤其是α-地贫的人群携带率达17.55%。从而首次明确了广西地区α-地贫的携带率在中国南方是最高的,我们还首次报道了中国广西地区δ-地贫的携带率(1.36%)。本研究阐述了广西普通人群中的Hb H病及中间型地贫的携带率和基因型。此外,我们通过对5789例样品全部进行分子筛查的方法,首次准确报道了三种常见的静止型α-地贫突变(-α3.7,-α4.2和αWSα)在广西地区的流行情况。与以往所进行的研究通常基于病人而言,本研究通过血液学表型和基因型分析相结合的方式,首次确定了普通人群中血红蛋白病的携带率。将我们的研究结果与已有的结果相比,α-和β-地贫均呈现出较高的携带率。我们认为这一现象的原因主要是因为本研究采取了先进技术,以及明确了静止型α-地贫的携带率。 本研究分析了血红蛋白病在广西地区三个主要的民族(汉、壮和瑶)之间的分布特点。除了α-地贫在汉族与壮族,汉族与瑶族之间的差异有统计学意义之外,α-地贫在壮族和瑶族及β-地贫在三个民族中的分布无显著差别。我们认为,这一结果应该可以进一步证明中国人群可能起源于同一个种族,壮族及瑶族与汉族之间α-地贫突变携带率的差异可能是遗传漂变和居住地相对隔离及特殊风俗如近亲通婚等原因所致。同时,通过分析血红蛋白病在广西不同地区的分布情况,我们可以看出α-、β-地贫的分布和携带率与G6PD缺乏症相一致,从而进一步证明α-、β-珠蛋白基因突变与G6PD基因突变可能同时有对抗疟疾的作用。 根据我们的研究结果及目前广西地区每年70万新出生人口,我们估算出在广西地区每年可能生出重型或中间型β-地贫、Bart's水肿胎儿和Hb H病的患儿数分别是724(95%CI,603～897)、1095(95% CI,935～1337)和1327(95% CI,1148～1610),每1000次妊娠中,风险妊娠的概率分别是0.103%、0.156%和0.758%。 本研究的结果显示,血红蛋白病特别是α-和β-地贫在广西地区已成为很严重的公共卫生问题。我们的调查结果对于地贫的人群预防有以下指导意义：(1)α-和β-地贫在广西地区均有一个比较窄的突变谱,6种常见的α-地贫突变和8种常见的β-地贫突变分别约占α-和β-地贫的99%和98%。我们可以据此设计经济有效的分子检测方法。(2)α-复合β-地贫在广西地区的携带率高达1.36%。因此遗传咨询时,如果夫妻中一方有α-地贫或β-地贫时,另一方都应检测α-地贫突变。(3)除了Hb CS, Hb QS, Hb WS、Hb E等能导致地中海贫血的异常血红蛋白,其余的异常血红蛋白以及δ-地贫在广西地区的发生率比较低。δ-地贫在广西人群中的携带率为0.16%,远低于意大利(2.5%)与塞浦路斯(1.47%)人群的携带率。因此我们认为,δ-合并β-地贫所致的误诊现象在广西地区应该也比较少。在鉴别到的9种异常血红蛋白类型中,仅Hb Q-Thailand表现出轻度的地中海贫血表型。进行遗传咨询时,应予注意。(4)Hb H病和中间型地贫的预防在产前诊断中非常重要。两种常见的基因型应引起高度注意,一是--SEA／合并Hb WS突变(—SEA/αwsα)所致的Hb H病；二是由β-地贫杂合子合并α-珠蛋白基因三联体所致的中间型β-地贫。这两种基因型均可以表现出由轻至重的表型多样性。我们需要帮助高风险夫妇了解该病,并决定是否需要产前诊断或终止妊娠。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R181.3
【部分图文】：

扩增受阻3’ GCCACGT二5’图3一 3ARMSPCR反应原理与引物设计示意图Rgure3一 ThePrinciPleandPrimersofARMS一PCR(2)ARMS一PCR反应条件PeR反应总体积为2501，含基因组 DNA10ong，0.2mmo比dNTp，各0.5协M上游和下游引物，10林 1ZxGCbuffer11，加入 3UTaq酶。热循环参数:95oC预变性3分钟，95℃40秒、58℃45秒、72℃45秒共30个循环，72℃后延伸5分钟。反应完后取5川PCR产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR是否成功。2.a一珠蛋白基因的反向点杂交技术的检测盼B是通过位于等位基因特异性寡核营酸 (allelespeeifieoligonueleotide

‘认点落占占履疾内，占禹久T令心图3一 SM[LpA检测突变肤失的技术原理Figure3一 5PrinciPleofMLPAdetection3.6.4家系回访对于a一地贫表型阳性，但经过上述系统的基因型分析没有查出基因异常的样本，我们采用家系回访的方法，联系木人及其父母检测血常规，观察其父母和本人复查血常规的结果，了解其贫血是否有遗传性因素所致，以排除其它原因所致的小细胞低色素贫血。3.6.5a一珠蛋白基因新突变分析通过上述系统的基因型检测，我们检测到2例样本携带a一珠蛋白基因新突变 aZCD13(GCC*Tee)(HBAZ:e.400>T，oe曲毗In.Gu14s033)。采集其中1例样本的家系外周血样，并检测其家庭成员的血液学表型和地贫基因突变，用实时定量反转录 pCR(reversetranseriptpCR，RT-pCR)方法评估新突变对a-珠蛋白mRNA表达水平的影响。

一对引物扩增正常a一珠蛋白基因的PcR产物为 1o02bP。检测结果显示，276例样本携带有一己7，91例样本携带有一己，，453例样本携带有一SEA缺失。部分样本的PCR检测结果见图4一1。 23456M4一 1.A(一SEA)4一 1.C(一a42)图4一1三种a一珠蛋白基因缺失(一sEA、一矿.7和一矿·2)PcR电泳检测结果，依次见今LA，B和e。呱 udderDNAMar旋r，北京鼎国。4一4.A，2、3、5、7为一sEA缺失阴性结果;i、4、6均为一sEA缺失杂合子样本。4一LB，7为一矿.7缺失阳性结果，其它为阴性结果。4一Lc，4为一了.2缺失缺失阳性结果
【引证文献】

相关期刊论文 前2条

1 胡洪玻;梁文旺;赵森莹;李日东;李小兰;;我院6个月～6岁住院患儿贫血状况分析[J];当代医学;2012年13期

2 胡洪玻;梁文旺;赵森莹;李日东;李小兰;蒋喜凤;;我院6个月～6岁住院患儿不同民族及地区贫血状况分析[J];中外妇儿健康;2011年04期

相关硕士学位论文 前1条

1 李雪丽;血红蛋白HbA2与HbF免疫学检测体系的建立与初步应用[D];南方医科大学;2012年

本文编号：2860688