基于单细胞荧光成像技术的消毒效果快速评价方法研究
发布时间：2021-09-17 07:41
目的:汽化过氧化氢（VHP）是一种高效、无毒、无残留的化学消毒剂,随着越来越多的人对绿色消毒剂的关注,VHP消毒净化系统被广泛应用于医院、微生物实验室、制药行业、食品制造生产等领域。对消毒效果的快速、准确评价在提高生物安全水平,降低病原微生物污染的风险,控制微生物污染等方面都具有重要意义。杀灭率是评价消毒效果的唯一指标,当前许多可用实现活/死菌区分鉴定的方法都可用于对消毒效果的定量评价,包括平板培养法、聚合酶链式反应（PCR）、显微荧光计数法、流式细胞检测法等。其中平板培养计数法是检测消毒效率的标准方法,该方法通过测量生物指示剂中的活菌含量实现对消毒效果的评价,对实验器材的要求低、检测成本低,然而检测过程耗时长,不适用于对消毒效果的即现场评价;PCR检测法技术成熟、灵敏度高、特异性强,但是对检测环境要求高,仪器价格昂贵;显微荧光计数法可以直观地给出检测结果,但是操作繁琐,需要专业技术人员进行操作;流式细胞检测法敏感性高、分析全面,然而检测通量较小,且检出限一般在103～104cfu/ml。因此,建立一种快速、准确的消毒效果评价方法对指导消毒工...
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SYTO9、AO、DAPI及PI的荧光光谱图
军事科学院硕士学位论文第9页1.1.2结果与分析1.1.2.1结果不同荧光染料对活菌和死菌的染色效果：如图1.2所示为四种核酸染料对枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC9372）活细胞和死细胞的染色结果。结果显示，SYTO9、AO和DAPI均可对死菌和活菌细胞无差别染色，而PI只能对死菌染色。然而，AO和DAPI染色后细胞的荧光强度明显弱于SYTO9的染色结果，而且相同浓度的菌悬液SYTO9对其的染色效果要优于AO和DAPI，具体表现为荧光信号多且发出区别于背景的明亮的绿色荧光。PI染色的活菌样本在荧光显微镜下视野内无明显可见荧光信号，但是PI染色的死菌在绿色激光激发下发出明亮的红色荧光。因此，研究初步选取SYTO9和PI作为死/活菌双重染色的荧光染料。图1.2枯草芽孢杆菌黑色变种的荧光染色结果。（a-d）分别为SYTO9、AO、DAPI和PI对活菌的染色结果；（e-h）分别为SYTO9、AO、DAPI和PI对死菌的染色结果。荧光染料对不同细菌的染色效果：为验证SYTO9和PI对不同菌种细菌细胞的染色效果，我们比较了SYTO9和PI对枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC9372），白色葡萄球菌（ATCC8032）和大肠杆菌（ATCC8099）的染色效果，如图1.3所示。荧光显微镜检测结果显示，SYTO9和PI对三种细菌的死/活菌染色效果良好，无显著差别，说明SYTO9和PI具有良好的稳定性，可对不同菌种进行无差别荧光标记。
军事科学院硕士学位论文第10页图1.3SYTO9和PI对不同细菌的荧光染色结果。（a-c）分别为SYTO9对枯草芽孢杆菌黑色变种，白色葡萄球菌和大肠杆菌活菌样本的染色结果；（d-f）分别为PI对枯草芽孢杆菌黑色变种，白色葡萄球菌和大肠杆菌死菌样本的染色结果。混合染料对死/活菌混合样本染色效果：由于不同荧光信号或来自染料的干扰，双重荧光染色与单一的荧光染色在实际应用中可能会存在差异。为获得最佳的混合染色效果，需要根据实际需求调整荧光染料的添加量，如图1.4所示为不同比例混合的SYTO9和PI的混合染料对死/活菌样本的染色结果，SYTO9和PI的光谱分离度好，联合使用能明显区分被测样本中的活菌和死菌细胞。实验结果显示，SYTO9染色后发出的高亮度绿色荧光会在抑制PI染色后发出的红色荧光，因此在进行双重荧光染色时需要补偿PI的剂量，当SYTO9:PI=3:4时对死/活菌混合样本的染色效果最佳。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化[J]. 吴俊,陆利霞,刘元建,林丽军,熊晓辉. 现代食品科技. 2019(02)
[2]基于反转录-环介导等温扩增技术检测沙门氏菌[J]. 梁玉林,刘秀,周振森,周鹏飞,尹建军. 微生物学通报. 2018(10)
[3]医疗机构医疗器械消毒灭菌监测结果分析[J]. 帖金凤,韩杰,武雪冰,张哲,魏秋华. 中国消毒学杂志. 2018(05)
[4]食品中致病性微生物污染状况分析以及危险性评估的应用[J]. 王晶晖. 现代食品. 2018(03)
[5]Applicability of LIVE/DEAD BacLight stain with glutaraldehyde fixation for the measurement of bacterial abundance and viability in rainwater[J]. Wei Hu,Kotaro Murata,Daizhou Zhang. Journal of Environmental Sciences. 2017(01)
[6]采用ATP生物发光法分析6株常见细菌ATP含量差异[J]. 田雨,侯玉柱,柯润辉,尹建军,宋全厚. 食品与发酵工业. 2015(01)
[7]医院消毒灭菌效果的监测与分析[J]. 胡玮,应瑶蓉,占利. 中国现代医生. 2014(12)
[8]常用消毒灭菌法效果评价[J]. 李晶. 北方药学. 2014(02)
[9]食源性病原微生物快速检测技术应用现状与发展趋势[J]. 陈爱亮. 食品安全质量检测学报. 2014(01)
[10]致病微生物应对环境胁迫形成的VBNC状态及其对风险评估的潜在影响[J]. 高鹤,赵勇,刘承初. 微生物学通报. 2014(01)
硕士论文
[1]ATP生物荧光法对消毒效果快速评价方法研究[D]. 陆烨.浙江大学 2016
[2]二维激光振镜扫描控制系统设计[D]. 徐亮亮.长春理工大学 2012
[3]PMA-qPCR选择性检测水中活性菌方法的研究与应用[D]. 仝铁铮.清华大学 2010
[4]双光子荧光显微镜的研究[D]. 王盛满.浙江大学 2006
本文编号：3398268
【文章来源】：军事科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SYTO9、AO、DAPI及PI的荧光光谱图
军事科学院硕士学位论文第9页1.1.2结果与分析1.1.2.1结果不同荧光染料对活菌和死菌的染色效果：如图1.2所示为四种核酸染料对枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC9372）活细胞和死细胞的染色结果。结果显示，SYTO9、AO和DAPI均可对死菌和活菌细胞无差别染色，而PI只能对死菌染色。然而，AO和DAPI染色后细胞的荧光强度明显弱于SYTO9的染色结果，而且相同浓度的菌悬液SYTO9对其的染色效果要优于AO和DAPI，具体表现为荧光信号多且发出区别于背景的明亮的绿色荧光。PI染色的活菌样本在荧光显微镜下视野内无明显可见荧光信号，但是PI染色的死菌在绿色激光激发下发出明亮的红色荧光。因此，研究初步选取SYTO9和PI作为死/活菌双重染色的荧光染料。图1.2枯草芽孢杆菌黑色变种的荧光染色结果。（a-d）分别为SYTO9、AO、DAPI和PI对活菌的染色结果；（e-h）分别为SYTO9、AO、DAPI和PI对死菌的染色结果。荧光染料对不同细菌的染色效果：为验证SYTO9和PI对不同菌种细菌细胞的染色效果，我们比较了SYTO9和PI对枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC9372），白色葡萄球菌（ATCC8032）和大肠杆菌（ATCC8099）的染色效果，如图1.3所示。荧光显微镜检测结果显示，SYTO9和PI对三种细菌的死/活菌染色效果良好，无显著差别，说明SYTO9和PI具有良好的稳定性，可对不同菌种进行无差别荧光标记。
军事科学院硕士学位论文第10页图1.3SYTO9和PI对不同细菌的荧光染色结果。（a-c）分别为SYTO9对枯草芽孢杆菌黑色变种，白色葡萄球菌和大肠杆菌活菌样本的染色结果；（d-f）分别为PI对枯草芽孢杆菌黑色变种，白色葡萄球菌和大肠杆菌死菌样本的染色结果。混合染料对死/活菌混合样本染色效果：由于不同荧光信号或来自染料的干扰，双重荧光染色与单一的荧光染色在实际应用中可能会存在差异。为获得最佳的混合染色效果，需要根据实际需求调整荧光染料的添加量，如图1.4所示为不同比例混合的SYTO9和PI的混合染料对死/活菌样本的染色结果，SYTO9和PI的光谱分离度好，联合使用能明显区分被测样本中的活菌和死菌细胞。实验结果显示，SYTO9染色后发出的高亮度绿色荧光会在抑制PI染色后发出的红色荧光，因此在进行双重荧光染色时需要补偿PI的剂量，当SYTO9:PI=3:4时对死/活菌混合样本的染色效果最佳。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化[J]. 吴俊,陆利霞,刘元建,林丽军,熊晓辉. 现代食品科技. 2019(02)
[2]基于反转录-环介导等温扩增技术检测沙门氏菌[J]. 梁玉林,刘秀,周振森,周鹏飞,尹建军. 微生物学通报. 2018(10)
[3]医疗机构医疗器械消毒灭菌监测结果分析[J]. 帖金凤,韩杰,武雪冰,张哲,魏秋华. 中国消毒学杂志. 2018(05)
[4]食品中致病性微生物污染状况分析以及危险性评估的应用[J]. 王晶晖. 现代食品. 2018(03)
[5]Applicability of LIVE/DEAD BacLight stain with glutaraldehyde fixation for the measurement of bacterial abundance and viability in rainwater[J]. Wei Hu,Kotaro Murata,Daizhou Zhang. Journal of Environmental Sciences. 2017(01)
[6]采用ATP生物发光法分析6株常见细菌ATP含量差异[J]. 田雨,侯玉柱,柯润辉,尹建军,宋全厚. 食品与发酵工业. 2015(01)
[7]医院消毒灭菌效果的监测与分析[J]. 胡玮,应瑶蓉,占利. 中国现代医生. 2014(12)
[8]常用消毒灭菌法效果评价[J]. 李晶. 北方药学. 2014(02)
[9]食源性病原微生物快速检测技术应用现状与发展趋势[J]. 陈爱亮. 食品安全质量检测学报. 2014(01)
[10]致病微生物应对环境胁迫形成的VBNC状态及其对风险评估的潜在影响[J]. 高鹤,赵勇,刘承初. 微生物学通报. 2014(01)
硕士论文
[1]ATP生物荧光法对消毒效果快速评价方法研究[D]. 陆烨.浙江大学 2016
[2]二维激光振镜扫描控制系统设计[D]. 徐亮亮.长春理工大学 2012
[3]PMA-qPCR选择性检测水中活性菌方法的研究与应用[D]. 仝铁铮.清华大学 2010
[4]双光子荧光显微镜的研究[D]. 王盛满.浙江大学 2006
本文编号：3398268
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