上海和内蒙古地区输血性传播病毒的流行病学调查及ORF1基因的克隆表达

发布时间：2017-09-07 21:41

  本文关键词：上海和内蒙古地区输血性传播病毒的流行病学调查及ORF1基因的克隆表达

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【摘要】：输血型传播病毒(Torque Teno virus,TTV)是由Nishizawa[1]于1997年在研究原因不明肝炎患者的过程中,用RDA(代表性差异技术)方法从一名58岁的日本患者血液中分离到的一种病毒,是继甲、乙、丙、丁、戊、己、庚之后的又一肝炎病毒--辛型肝炎病毒,从属与指环病毒科(Anellovirida)。该病毒为单股环状DNA,病毒基因组长度在2.1-3.9 KB之间,有两个主要的开放阅读框(ORF),ORF1可能编码病毒的主要结构蛋白,ORF2主要编码非结构蛋白。TTV能感染人、非人灵长类、猪、犬、猫、牛、羊、骆驼等哺乳动物,对禽类的感染也有报道,但是,TTV的大小及特性在不同物种中差异较大,仅人的TTV就存在40多个基因型。TTV感染范围较宽,传播途径较广,与人类隐性肝病密切相关,因此引起了世界各国学者的广泛关注。 本试验根据GeneBank公开发表的SAa-10(AB060594)全序列设计型特异性引物,通过巢式PCR方法检测来自上海某儿童医院的150份、年龄在1个月到8岁之间的儿童粪样和109份成年人血样,来自内蒙的96份中老年人的粪样,结果发现:内蒙96份中老年人粪样中没有阳性样品,上海150份儿童粪样中检测到3份,上海109份血样中有8份阳性,阳性样品的序列与SAa-10序列以及不同阳性样品序列间的同源性均在90%以上,说明TTV的感染不存在地域差异性,但是,感染率可能与年龄有一定的相关性。 参照SAa-10(AB060594)对其中一份阳性样品进行全序列扩增,命名为L-SH (HM224451),通过Cluster比对及Mega 4.0进行进化树分析表明,本实验分离株L-SH (HM224451)与日本株SAa-10(AB060594)的同源性达93.8%,进一步说明了同一基因型TTV之间不存在地域差异。对分离株L-SH ORF1中的蛋白,运用DNA-Star中Protean软件进行抗原表位分析,选取抗原表位密集的区域设计引物进行扩增,并连接到表达载体PET-30中,经IPTG诱导表达。结果发现,此蛋白能高效表达并以包涵体形式存在,为后续TTV的ELISA检测和疫苗抗原的研究进行有意义的探索。
【关键词】：TT病毒 流行病学调查 ORF1 克隆表达
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R181.3
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 1 引言8-18
• 1.1 发展简史9
• 1.2 TTV 作为一种新型肝炎病毒的发现9-12
• 1.2.1 历史9
• 1.2.2 理化性质9-10
• 1.2.3 单链环状 DNA 病毒10-11
• 1.2.4 TTV 的变异11-12
• 1.3 流行病学12-14
• 1.3.1 感染途径12-13
• 1.3.2 TTV 在不同人群中的感染率13-14
• 1.3.3 地区分布14
• 1.4 TTV 的检测方法14-15
• 1.5 TTV 和它的潜在致病性15-17
• 1.5.1 肝脏疾病15
• 1.5.2 血液疾病15-16
• 1.5.3 肺部疾病16
• 1.5.4 特发性炎症性肌病16
• 1.5.5 免疫抑制16
• 1.5.6 系统性红斑狼疮16-17
• 1.6 动物 TTV17-18
• 1.6.1 非人灵长类的 TTV17
• 1.6.2 其他动物的 TTV17-18
• 1.7 本研究的目的与意义18
• 2. 上海地区和内蒙古呼和浩特市地区人 TTV 的流行病学调查18-22
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 样品18
• 2.1.2 主要试剂18-19
• 2.1.3 主要仪器19
• 2.2 试验方法19-21
• 2.2.1 引物的设计与合成19
• 2.2.2 样品处理19
• 2.2.3 DNA 模板的制备19-20
• 2.2.4 目的片段的扩增20
• 2.2.5 PCR 产物的凝胶电泳检测20
• 2.2.6 PCR 产物凝胶回收20-21
• 2.2.7 回收产物与pMD18-T 载体连接反应21
• 2.2.8 转化及测序21
• 2.3 结果与讨论21-22
• 2.3.1 样品中TTV 第20 型 SAa-10 的检测21-22
• 2.3.2 讨论22
• 3. TTV 基因的全长扩增22-28
• 3.1 主要试剂和仪器23-24
• 3.1.1 主要试剂23
• 3.1.2 主要仪器23
• 3.1.3 材料23
• 3.1.4 引物设计23-24
• 3.2 试验方法24-25
• 3.2.1 PCR 扩增24
• 3.2.2 电泳24
• 3.2.3 PCR 产物凝胶回收24-25
• 3.2.4 回收产物与pMD18-T 载体连接反应25
• 3.2.5 转化及测序25
• 3.3 结果与分析25-28
• 3.3.1 结果25-27
• 3.3.2 进化分析27-28
• 3.4 讨论28
• 4. TTV ORF1 基因的原核表达载体的构建和表达蛋白的纯化28-38
• 4.1 材料29
• 4.1.1 样品、菌株和质粒29
• 4.1.2 主要试剂29
• 4.1.3 主要仪器29
• 4.2 试验方法29-34
• 4.2.1 引物的设计与合成29-30
• 4.2.2 PCR 扩增30
• 4.2.3 目的片段的回收30-31
• 4.2.4 目的基因的克隆31
• 4.2.4 克隆质粒的构建31-32
• 4.2.5 原核表达载体PET-30a-ORF1 的构建32-33
• 4.2.6 重组表达载体的诱导表达33
• 4.2.7 最优表达时间的确定33-34
• 4.2.8 表达产物的纯化34
• 4.2.9 表达产物的复性34
• 4.3 结果34-37
• 4.3.1 ORF1 基因的 PCR 结果34-35
• 4.3.2 目的基因的克隆鉴定35
• 4.3.3 重组表达载体的鉴定35-36
• 4.3.4 蛋白原核表达及最优表达时间的确定36
• 4.3.5 蛋白的可溶性分析36-37
• 4.3.6 蛋白的纯化与复性37
• 4.4 讨论37-38
• 5. 结论38
• 6. 展望38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-45
• 作者简历45

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：810059