登革热流行病学调查及重症登革热病理机制研究

发布时间：2017-09-21 12:07

  本文关键词：登革热流行病学调查及重症登革热病理机制研究

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【摘要】：本研究首先对中国的登革热流行病学进行系统描绘,并从GenBank数据库中筛查出所有分离自中国的登革基因序列共749条,进行进化发育分析。结果显示,自1978年至2014年间,我国共计报告登革热感染病例累计达735735例。1978年～1991年间疫情主要集中在广东省和海南省,自1991年后集中在广东、云南、浙江和福建四省,占全国感染病例的90%以上。死亡人数有507人,多数在1988年以前。感染人群的年龄分布呈扇形,集中在20～45岁之间。流行的登革毒株主要为Ⅰ型和Ⅱ型,呈交叉循环或共同感染模式。存在本地循环传播和各省跨时空循环传播交替出现的特点,也存在同一毒株的本地延续性传播。将2013年云南登革流行株全基因序列与Ⅲ型登革病毒标准株对比,确定共有62个氨基酸突变,与其亲缘关系最近的为2013年海南流行株及2002年孟加拉国流行株。2015年获得的17个登革全基因序列经内部比对,共找到217处碱基突变位点,其中非结构蛋白区域共有213处。将42个结构蛋白基因序列与Ⅱ型标准株进行比对,共发现36个氨基酸突变产生。进化分析显示,该流行株与2004年斯里兰卡流行株及2001年印度流行株属于同一进化分支。对375例登革热患者进行临床病理分析,发现患者普遍存在不同程度的炎症反应、血管渗漏和肝损伤。血清中病毒载量并不是导致重症登革热的唯一原因,NSl含量、补体的合成和消耗与重症登革热具有相关性。利用Ⅱ登革病毒及其同型别前膜蛋白prM抗体建立人全血ADE模型,发现ADE感染组病毒拷贝数高于普通感染组2.94倍,补体C3水平降低61.5%。两个登革感染组上清中均有大量C3a、C5a产生,补体C3bBb含量也明显升高,其中ADE组高于普通感染组2.6倍,而C1q含量变化不大,证明补体旁路途径过度激活是ADE感染过程中的效应机制之一。最后利用阴性分离的单核细胞建立抗体依赖增强感染体外模型。两个登革感染组上清中均有大量C3a、C5a产生,伴随IL-10的表达升高。经免疫共沉淀、质谱鉴定及Western Blot验证,证明膜辅助蛋白CD46与NS1具有相互作用。与单核细胞ADE模型共培养后免疫荧光染色检测HuVEC表面C5b-9的形成,伊红染色观察细胞骨架改变。结果ADE组HuVEC有明显的病理损伤,提示补体过度激活可能是导致血管内皮细胞损伤和血管渗漏的原因之一。综合上述研究结果,我们提出了“补体风暴”假说。即登革病毒NS1在细胞中大量复制并游离至血液中,循环迁移到全身各处。通过竞争结合补体调控因子CD46,使CD46散失或部分抑制对补体的调控作用,引起补体旁路途径过度活化,产生大量补体裂解片段,导致类似超敏反应的全身性临床症状。
【关键词】：登革病毒 流行病学研究 抗体依赖性增强感染 CD46 补体风暴
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.8;R181.3
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 登革热分子流行病学研究10-55
• 前言10-11
• 1 登革病毒的生物学特征11-14
• 1.1 登革病毒的分子结构和基因组11-12
• 1.2 登革病毒的复制和传播途径12-14
• 1.3 世界范围内登革热的流行概况14
• 2 中国历年登革热流行情况的回顾性研究14-27
• 2.1 研究方法概述14-17
• 2.2 中国历年登革热的地理分布17-20
• 2.3 中国历年登革热的时间分布20-21
• 2.4 中国历年登革热的人口分布21-23
• 2.5 中国历年登革热的型别分布23
• 2.6 中国历年登革热流行株的进化发育研究23-27
• 3 云南省西双版纳州登革热分子流行病学研究27-50
• 3.1 概述27-29
• 3.2 材料与方法29-34
• 3.3 2013年西双版纳州登革热流行病学研究34-42
• 3.4 2015年西双版纳州登革热流行病学研究42-50
• 讨论50-55
• 第二部分 重症登革热临床病理观察55-71
• 前言55-56
• 1 研究背景及实验思路56-58
• 2 材料与方法58-63
• 2.1 临床研究设计及参与者招募58
• 2.2 实验材料58-59
• 2.3 实验方法59-63
• 3 结果63-68
• 3.1 登革热血清中非结构蛋白NS1含量检测63-64
• 3.2 登革热血清样本的常规血液指标检测结果64
• 3.3 登革热血清中登革热病毒载量检测64-66
• 3.4 登革热血清中免疫球蛋白IgG/IgM/IgA水平检测66-67
• 3.5 登革热血清中补体C3/C4水平检测67-68
• 讨论68-71
• 第三部分 补体与重症登革热的相关性研究71-84
• 前言71-75
• 1 材料与方法75-78
• 1.1 白纹伊蚊细胞培养75
• 1.2 登革病毒毒株扩增及鉴定75
• 1.3 收获病毒液的滴度测定75-76
• 1.4 人血清抗体依赖增强补体裂解模型的建立76
• 1.5 人全血抗体依赖增强感染模型的建立76
• 1.6 免疫比浊法测定补体C376-77
• 1.7 C3裂解产物(C3SP)C3a的定量检测77-78
• 1.8 补体裂解产物C5a、C3bBb、C1q的定量检测78
• 2 结果78-82
• 2.1 登革病毒的型别鉴定78-79
• 2.2 利用人血清建立抗体依赖增强补体裂解模型79
• 2.3 利用人全血建立ADE模型79-80
• 2.4 利用人全血ADE模型研究补体活化途径80-82
• 讨论82-84
• 第四部分 补体旁路途径过度激活导致重症登革热的病理机制研究84-103
• 前言84
• 1 材料与方法84-92
• 1.1 人外周血淋巴细胞（PBMC）分离及培养84-85
• 1.2 人外周血单核细胞初步纯化（Monocytes）85
• 1.3 美天旎MAC阴性磁珠分选人外周血单核细胞85-86
• 1.4 阴性磁珠分选的人外周血单核细胞纯度鉴定86
• 1.5 人外周血单核细胞培养条件摸索86-87
• 1.6 人外周血单核细胞抗体依赖增强感染（ADE）模型的建立87
• 1.7 C3a、C5a含量检测87
• 1.8 ELISA法定量检测登革热血清中细胞因子IL-10含量87-88
• 1.9 免疫共沉淀（Co-Immunopredpitation, Co-IP）88-89
• 1.10 SDS-PAGE鉴定免疫共沉淀收获液89
• 1.11 质谱鉴定SDS-PAGE中的目标蛋白89
• 1.12 Western Blot定性验证质谱结果89-90
• 1.13 利用Transwell细胞培养皿进行单核细胞ADE模型-HuVEC共培养90-91
• 1.14 免疫荧光染色检测HuVEC表面的补体膜攻击复合物C5b-991
• 1.15 伊红染色显示与单核细胞ADE模型共培养后HuVEC细胞骨架改变91-92
• 2 结果92-100
• 2.1 流式细胞术鉴定磁珠阴性分选的单核细胞纯度92
• 2.2 单核细胞最适培养条件92-94
• 2.3 利用人外周血单核细胞建立抗体依赖增强感染模型94-96
• 2.4 C3a、C5a、IL-10含量检测96-97
• 2.5 利用单核细胞ADE模型进行免疫共沉淀97-98
• 2.6 目标蛋白的质谱鉴定98-99
• 2.7 Western Blot验证质谱鉴定结果99
• 2.8 免疫荧光染色检测HuVEC表面的补体膜攻击复合物C5b-999-100
• 2.9 伊红染色检测HuVEC的细胞骨架改变100
• 讨论100-103
• 全文总结103-112
• 参考文献112-119
• 附录119-125
• 致谢125-126
• 个人简历126-129

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