淡色库蚊酚氧化酶proPOA3基因克隆及其与溴氰菊酯抗性关系的研究

发布时间：2017-09-22 12:36

  本文关键词：淡色库蚊酚氧化酶proPOA3基因克隆及其与溴氰菊酯抗性关系的研究

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【摘要】：蚊可传播疟疾、登革等多种疾病(蚊媒病),严重危害人类健康。化学防制一直是蚊媒综合治理的主要方法。杀虫剂大量、持续使用导致了蚊抗药性的发生和发展。目前,杀虫剂抗性已成为蚊媒病防制工作的最大障碍。抗药性是由基因决定的,发现和研究蚊媒杀虫剂抗性相关基因及其作用机制,有助于阐明抗药性的分子基础和治理抗药性。 本实验前期研究从淡色库蚊(Culex pipiens pallens)溴氰菊酯敏感和抗性品系中分离、鉴定出多个表达差异序列,其中包括酚氧化酶原亚单位A3(prophenoloxidase subunit A3,proPOA3).在此基础上,本研究采用RT-PCR以及cDNA末端快速扩增(rapid amplification o f cDNA end,RACE)技术扩增淡色库蚊proPOA3基因；在细胞水平通过转染方法,研究proPOA3高表达对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响；随后通过实时定量PCR法鉴定了proPOA3基因在溴氰菊酯不同抗性水平蚊中的差异表达;最后应用PCR、基因序列分析等方法研究proPOA3基因点突变与溴氰菊酯表型的关系。 本研究的主要结果如下： 本研究获得的淡色库蚊proPOA3全长序列共2349bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为2061bp,编码686个氨基酸(GeneBank登录号：FJ755838.1,2009)。序列分析显示,该基因在物种中保守性较高,推导的氨基酸序列与已报道致倦库蚊(Cx.quinquefasciatus)的proPOA3具有98%同源性,并具有经典的酚氧化酶含铜中心结构,表明该基因为淡色库蚊proPOA3. 构建淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体并转染蚊细胞,CCK-8检测发现,在高浓度溴氰菊酯(101.5μg/ml和102.0μg/ml)作用下,proPOA3转染组的存活率低于对照组(p0.05),即高表达proPOA3后蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性增强,提示proPOA3基因可能参与溴氰菊酯抗性的形成,为1个新的蚊抗药性相关基因。 实时定量PCR结果显示,淡色库蚊proPOA3基因在无锡、南京、唐口和禹城4地现场自然种群溴氰菊酯敏感组中均高表达,分别为抗性组的2.60倍、6.33倍、4.33倍和5.02倍(均p0.05)。对其它蚊种现场自然种群的进一步分析表明,proPOA3在三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhynchus)溴氰菊酯敏感组中是抗性组的5.03倍(p0.05),但在中华按蚊(A nopheles. sinensis)和微小按蚊(An. minimus)的敏感组、抗性组之间无显著性差异(均p0.05)。此外,在实验室淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选试验中,发现proPOA3的转录水平随着溴氰菊酯抗性水平(LCso)的增加而降低,两者具有显著负相关性(p0.05)。本结果进一步验证proPOA3基因的表达与库蚊溴氰菊酯抗性负相关,提示该基因可望作为库蚊拟除虫菊酯抗性现场检测的分子靶标,值得进一步研究。 对proPOA3的基因型分析提示,淡色库蚊存在2个突变位点、3种突变型(769GA、1116GC和1116GA)。769GA属于非同义突变(non-synonymous mutation),导致缬氨酸突变为异亮氨酸；1116GC和1116GA属于同义突变(synonymous mutation),相应位置氨基酸未发生变化。其中,769GA和1116GC突变是同时出现的,当769位碱基发生纯合突变(G/G→A/A)时,1116位碱基也为纯合突变(G/G→C/C)；当769位碱基为杂合突变(G/G→G/A)时,1116位碱基也为杂合突变(G/G→G/C)。青岛、微山、南京、无锡和淮北5地自然种群淡色库蚊经生物测定后,分别检测上述突变在敏感品系和抗性品系中的频率。769GA(1116GC)突变在抗性品系中的频率分别为：42.86%(青岛)、11.54%(微山)和23.92%(南京),均显著高于敏感品系：5.56%(青岛)、0%(微山)和0%(南京),该突变在无锡和淮北敏感、抗性品系中却均未被检测出。1116GA突变只在无锡自然种群中被检测出,其中抗性种群为13.64%,敏感种群为9.52%,无显著性差异(p0.05)。淮北自然种群未检测出上述3种突变。在实验室溴氰菊酯逐代筛选蚊实验中,发现769GA(1116GC)突变频率随着溴氰菊酯剂量增加呈规律性增加趋势,两者具有显著正相关性(p0.05)；而1116GA突变在第14代检测时则已消失。以上实验结果提示,在溴氰菊酯抗性的发生、发展过程中,769GA(1116GC)突变可能具有重要作用,而1116GA突变可能与溴氰菊酯抗性不相关或不直接相关,均有待进一步研究。 本研究首次报告了淡色库蚊proPOA3全长序列,发现proPOA3为1个新的蚊抗药性相关基因,存在2个突变位点、3种突变型,研究结果为阐明抗药性分子机理和治理抗药性提供了科学依据,具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。
【关键词】：淡色库蚊 溴氰菊酯 杀虫剂抗性 酚氧化酶 基因突变
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R184
【目录】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 淡色库蚊proPOA3基因克隆与鉴定17-36
• 材料与方法17-28
• 1 材料17-18
• 1.1 供试蚊17
• 1.2 主要试剂17-18
• 1.3 主要仪器18
• 2 方法18-28
• 2.1 淡色库蚊proPOA3克隆18-27
• 2.2 生物信息学分析27-28
• 结果28-34
• 1 淡色库蚊proPOA3克隆28-30
• 1.1 淡色库蚊RNA的提取及鉴定28
• 1.2 淡色库蚊proPOA3基因ORF序列扩增28-29
• 1.3 淡色库蚊proPOA3基因5’端以及3’端序序列扩增29-30
• 1.4 淡色库蚊proPOA3基因全长序列拼接30
• 2 淡色库蚊proPOA3基因生物信息学分析30-34
• 2.1 淡色库蚊proPOA3基因序列分析30
• 2.2 淡色库蚊proPOA3基因同源性分析30-33
• 2.3 淡色库蚊proPOA3基因进化树分析33
• 2.4 淡色库蚊proPOA3基因编码蛋白结构域分析33-34
• 讨论34-36
• 第二部分 淡色库蚊proPOA3基因高表达对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响36-55
• 材料与方法36-49
• 1 材料36-37
• 1.1 供试蚊及细胞系36-37
• 1.2 主要试剂37
• 1.3 主要仪器37
• 2 方法37-49
• 2.1 淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体构建38-41
• 2.2 淡色库蚊proPOA3瞬时转染对蚊细胞溴氰菊酯敏感性测定41-43
• 2.3 瞬时转染效率鉴定43-49
• 结果49-52
• 1 淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体构建49-50
• 2 ProPOA3瞬时转染鉴定50-51
• 2.1 RT-PCR鉴定50
• 2.2 Western blot鉴定50-51
• 3 淡色库蚊proPOA3 高表达后蚊细胞对溴氰菊酯敏感性的变化51-52
• 讨论52-55
• 第三部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊种群中的表达分析材料与方法55-67
• 材料与方法55-61
• 1 材料55-56
• 1.1 供试蚊55-56
• 1.2 主要试剂56
• 1.3 主要仪器56
• 2 方法56-61
• 2.1 淡色库蚊现场自然种群proPOA3的表达分析56-58
• 2.2 三带喙库蚊、中华按蚊和微小按蚊现场自然种群proPOA3的表达分析58-59
• 2.3 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3的表达分析59-61
• 结果61-65
• 1 ProPOA3在淡色库蚊自然种群敏感、抗性组中的表达差异61
• 2 ProPOA3在不同蚊种自然种群敏感、抗性组中的表达差异61-62
• 3 ProPOA3 在淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群中的表达差异62-65
• 3.1 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群的实验室选育62
• 3.2 ProPOA3在淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群中的表达变化62-65
• 讨论65-67
• 第四部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊种群中的基因多态性分析67-78
• 材料与方法67-71
• 1 材料67-68
• 1.1 供试蚊67-68
• 1.2 主要试剂68
• 1.3 主要仪器68
• 2 方法68-71
• 2.1 淡色库蚊自然种群proPOA3基因的多态性分析68-70
• 2.2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因的多态性分析70-71
• 结果71-75
• 1 淡色库蚊自然种群proPOA3基因多态性检测71-72
• 1.1 单蚊基因组DNA提取71
• 1.2 淡色库蚊自然种群proPOA3基因多态性71-72
• 2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因多态性检测72-75
• 2.1 单蚊基因组DNA提取72
• 2.2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因多态性变化72-75
• 讨论75-78
• 参考文献78-89
• 综述89-103
• 参考文献98-103
• 攻读学位期间发表文章情况103-104
• 致谢104

【参考文献】

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本文编号：900870