基于风险决策的眼刺激性评价组合替代方法的研究

发布时间：2017-10-06 07:31

  本文关键词：基于风险决策的眼刺激性评价组合替代方法的研究

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【摘要】：研究背景及目的 化学物质引起的局部眼刺激作用，通常涉及结膜、角膜、虹膜和泪腺的刺激效应，以角膜的刺激作用为首，其次是结膜、虹膜。传统的眼刺激作用，采用动物试验进行评价，鉴于其备受质疑的合理性和伦理性，此法已不能满足当前产品风险评估和法规管理的需要。基于体内眼刺激作用发生的机制，目前已开发了多种替代动物试验的方法。单一体外方法可较好地模拟复杂眼损伤作用中的某个方面，但如何组合使用，以满足实际工作需要，尚有待深入研究。因此，有必要根据角膜损伤的发生机制，结合体外方法的原理和标准化应用程度，对目前眼刺激实验的诸多替代方法的科学性和适用性进行评估。在此基础上，根据试验目的，建立成组的体外方法策略，以完全取代动物测试，满足风险决策和安全评价的需要。 本研究建立鸡胚尿囊膜绒毛膜苔盼蓝染色实验（Chicken ChorioallantoicMembrane-Trypan Blue Staining，CAM-TBS）、红细胞溶血实验（Red blood cellhaemolysis test，RBC）和SIRC细胞短时暴露实验（Short-term exposure，STE）三种眼刺激实验替代方法，并评估其单独或组合用于风险决策系统的科学性和局限性。为下一步建立眼刺激实验体外替代方法的组合模式提供支持。以满足替代动物实验的法规要求，也为产品安全性评价的风险决策提供资料。是今后推动我国眼刺激评价的体外标准化检测方法的铺垫。 研究方法 1鸡胚尿囊绒毛膜苔盼蓝染色实验（CAM-TBS） 该实验利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点，在定性观察的基础上，建立定量检测的方法。通过观察化合物作用于CAM引发出血、血管溶解和凝血反应的损伤程度，并测定CAM吸收台盼蓝的量，从而定量检测受试物损伤作用，提高了实验的可重复性。 2红细胞溶血实验（RBC） 通常具有眼刺激作用的物质也能使蛋白质变性或细胞膜溶解。将化合物直接接触哺乳动物的红细胞，通过定量检测红细胞溶血，以及释放出细胞外的血红蛋白变性程度，模拟类似角膜的损伤作用。 3SIRC细胞短时暴露实验（STE） 化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用。通过检测细胞毒性指标，可反应角膜损伤的程度。实验采用体外培养的兔角膜细胞（SIRC），短期暴露细胞于化合物，模拟急性角膜刺激作用，计算细胞活性、生长的抑制程度，及其与化学物的浓度-效应关系。 4提出替代方法的组合策略 基于危害物质风险评估的基本理论与原则，在参考国内外眼刺激试验最新法规认可与标准进展的基础上，提出以三种替代方法为主体的眼刺激试验风险评估组合策略。 实验结果 1鸡胚尿囊绒毛膜苔盼蓝染色实验（CAM-TBS）苔盼蓝浓度与吸光度OD值间存在正相关，回归模型表达式为y=0.2968+0.0004x 回归系数的区间估计：95%CI=[0.0002，0.0005]。R2=0.8994，表明利用苔盼蓝浓度变量可以解释吸光度OD值变异情况的89.94%。 2红细胞溶血实验（RBC） 对RBC实验与Draize实验的受试物分类做配对资料的Wilcoxon符号秩和检验，得S=1.8182，p=0.9976，在检验水准α=0.05的水平下，两者之间的差异没有统计学意义。经一致性检验，得出Kappa=0.6356，置信区间为[0.3930,0.8781]；RBC实验和Draize兔眼实验结果的一致性较好。 3SIRC细胞短时暴露实验（STE） SIRC细胞短时暴露实验（STE）所分的结果，与Draize兔眼实验分类结果相比较，经过kappa一致性检验，kappa值=0.6316，95%可信区间为[0.4040,0.8592]，两种分类一致性较好。 4替代方法组合试验策略 本组合适用于无刺激性到严重刺激性范围内眼刺激危害性的评价，对于无刺激性到中等刺激性的区分优势明显，三种方法组合流程见下图。 根据受试物的理化特性，预期为有刺激性的物质先进行CAM-TBS测试，若测试结果为严重刺激性，则可直接分类为严重刺激性；若测试结果为非严重刺激性，则进行细胞短期暴露测试或红细胞溶血试验，若为表面活性剂或含表面活性剂配方，则进行红细胞溶血试验，其它物质则选择细胞短期暴露试验，根据试验结果可对受试物眼刺激性分类。 预期为无刺激性的物质，若为可溶性物质或配方，，先进行细胞短期暴露测试，若测试结果为无刺激性，则可直接分类为无刺激性；若为表面活性剂或含表面活性剂配方，则需要补充红细胞溶血试验加以确认或直接用此法进行测试。若结果有刺激性，则进行CAM-TBS测试，确认并区分刺激的严重程度。 结论 本研究选择CAM-TBS、RBC和STE三种眼刺激实验替代方法，模拟结膜和角膜受损的机制，在改进试验材料和试验方案的基础上，探索建立替代实验组合。实验结果与Draize兔眼实验结果相比，这三种方法的体内相关性、分级一致性和结果重现性均良好。 三种方法均可定量检测化合物的眼刺激性。并且三者适用于不同的化合物，化合物的眼刺激性分类范围也不同。对于严重刺激性物质，CAM-TBS实验分类较好；中等/温和刺激性物质分类，RBC实验分类较好；弱/无刺激性物质分类，STE实验分类较好。CAM-TBS实验可用于测试单一化合物或混合物，该方法不适合用于有色严重刺激性物质的分类。RBC实验与STE实验适用于可溶解性物质的检测，但不适用于难溶物质或混合物的测试，且前者对表面活性剂更敏感。 综合考虑三种方法的优点和局限性，初步提出组合使用结论：CAM-TBS实验与RBC实验组合对严重刺激性物质分类较准确；CAM-TBS实验与STE实验组合分类对无刺激到中等刺激性物质分类相对一致性高；RBC实验与STE实验组合适用于弱/无刺激性可溶解性物质的分类。
【关键词】：风险决策 眼刺激实验 替代实验组合
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R77;R181.3
【目录】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-21
• 1 眼刺激的风险来源及法规管理15-16
• 1.1 眼刺激的风险来源15
• 1.2 眼刺激性的法规管理15-16
• 1.3 国际贸易法规对眼刺激试验的影响16
• 2 眼刺激的替代试验16-18
• 2.1 眼刺激动物试验的局限17
• 2.2 替代方法的科学依据17-18
• 3 替代方法研究进展18-19
• 4 基于风险决策的眼刺激组合模式研究19-21
• 4.1 眼刺激风险决策程序的变化19
• 4.2 替代方法的组合19-21
• 一、材料与方法21-40
• 1 材料21-24
• 1.1 已知刺激性化合物21-22
• 1.2 仪器及耗材22-23
• 1.3 常用试剂23-24
• 1.4 常用溶液及其配方24
• 2 方法24-40
• 2.1 鸡胚尿囊膜绒毛膜苔盼蓝染色实验24-27
• 2.1.1 实验准备24-25
• 2.1.2 实验步骤25-26
• 2.1.3 参数指标26
• 2.1.4 计算公式26
• 2.1.5 统计方法26-27
• 2.2 红细胞溶血实验27-30
• 2.2.1 实验准备27-29
• 2.2.2 实验步骤29
• 2.2.3 参数指标29-30
• 2.2.4 计算公式30
• 2.2.5 统计方法30
• 2.3 SIRC 细胞短时暴露实验30-36
• 2.3.1 实验准备31-35
• 2.3.2 实验步骤35-36
• 2.3.3 参数指标36
• 2.3.4 计算公式36
• 2.3.5 统计方法36
• 2.4 Draize 兔眼实验36-40
• 2.4.1 实验准备37
• 2.4.2 实验步骤37
• 2.4.3 观察与评分标准37-38
• 2.4.4 结果评价38-40
• 二、结果40-48
• 1 鸡胚尿囊膜绒毛膜苔盼蓝染色实验（CAM-TBS）40-43
• 1.1 苔盼蓝浓度与吸光度 OD 值之间的关系40-41
• 1.1.1 Pearson 相关分析40
• 1.1.2 回归分析40-41
• 1.2 单位膜重量吸收苔盼蓝的量（nmol/mg）41-43
• 1.3 Kappa 一致性检验43
• 2 红细胞溶血实验（RBC）43-44
• 2.1 化合物与红细胞悬液作用的体积比43
• 2.2 测量吸光度 OD 值选用的波长43-44
• 2.3 数据统计处理44
• 3 SIRC 细胞短时暴露实验（STE）44-46
• 4 DRAIZE 兔眼实验46
• 5 三种方法一致性的比较46-47
• 6 替代方法组合试验策略47-48
• 三、讨论48-53
• 1 眼刺激体外方法的研究48-49
• 2 眼刺激性的风险决策49-51
• 2.1 眼刺激风险决策的考虑因素49
• 2.2 眼刺激风险的决策树49-51
• 3 替代方法的分层组合策略51-53
• 3.1 组合策略中体外方法选择原则51
• 3.2 替代方法的分类51-52
• 3.3 三种替代方法的组合52-53
• 四、结论53-54
• 参考文献54-58
• 综述58-66
• 参考文献64-66
• 读研期间发表（撰写）的论文及申请的专利66-67
• 附录（英文缩略词表）67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 廖艳,王雪,张立实,李冠民,张宝旭;血红蛋白变性试验替代眼刺激试验的实验研究[J];四川大学学报(医学版);2004年05期

2 王红梅;马玲;穆效群;;Hela细胞MTT试验作为眼刺激替代试验的研究[J];实验动物科学;2007年02期

3 王红梅,马玲,姚小曼;鸡胚绒毛尿囊膜血管试验与家兔眼刺激试验方法的比较[J];卫生毒理学杂志;2002年03期

4 敖华英;程树军;潘芳;谈伟君;;化妆品眼刺激试验替代方法标准化与展望[J];中国比较医学杂志;2012年01期

5 杨光宇;杨杏芬;杨颖;贺锡雯;熊习昆;谢晓萍;谭小华;;荧光素漏出试验替代整体兔眼刺激试验的初步研究[J];中国卫生检验杂志;2007年03期

本文编号：981509