p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用研究

发布时间：2017-10-09 15:17

  本文关键词：p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用研究

  更多相关文章： 转基因小鼠鉴定 小鼠全脑缺血再灌注损伤 存活率曲线 p-p38 c-caspase-3 TTC 梗死体积 行为学评分 TUNEL 转基因p38~(KI/+)小鼠 p-p38表达 行为学 凋亡 保护作用

【摘要】：全脑缺血在临床上很常见,多表现为心肌梗死、休克、窒息等症状造成的脑部血液低灌流。脑缺血再灌注损伤指脑缺血后脑细胞被损伤,恢复血液再灌注后,不仅不能使组织器官功能恢复,反而其缺血性损伤进一步加重的现象。缺血再灌注损伤在许多重要器官包括心、脑、肝、肺、肾、胃肠道等均可发生。脑缺血损伤范围广泛,如海马等缺血损伤敏感区易发生迟发性神经元死亡。海马与情绪、内脏活动、近期记忆的形成有关,因此,以鼠脑缺血再灌流模型模拟人类脑血管病进行研究也显得尤为重要。近几年来,缺血性脑血管病发病率的有逐年上升的趋势,相关动物模型的构建也受到了广泛的关注。双侧颈总动脉夹闭法因其操作简单、损伤较小、动物死亡率低、模型成功率高和缺血再灌注时间易于控制,且能很好模拟人类脑梗塞再灌时脑组织病理生理的演变过程等优点倍受研究者们的青睐。脑缺血/再灌注损伤是多种机制参与的一种复杂的病理生理过程,多种环节因素之间又发生互相作用。神经元凋亡是损伤后的最常见形式之一,凋亡过程又受基因所调控。p38 MAPK可参与细胞生长、增殖、分化、死亡及细胞间的功能同步等多种生理过程。脑缺血神经元损伤后,早期p38 MAPK被激活进而缺血区的胶质细胞和神经元表达增加,并表现出时间的相关性,提示p38 MAPK信号通路在脑缺血神经元死亡过程中起着重要的调控作用。因此,在信号通路水平阻断和调控p38 MAPK的表达和活性可能成为治疗缺血型脑卒中的新的途径之一。基于此,我们将建立全脑缺血再灌注小鼠模型,观察全脑缺血再灌注后p38MAPK表达的变化及神经元凋亡的情况,旨在探讨缺血致神经元凋亡的机制,并观察p38 MAPK抑制对缺血受损神经元的保护作用,以期为临床脑缺血损伤后的治疗提供实验指导。本课题研究内容分以下三部分。第一部分、小鼠脑缺血再灌注模型的建立第二部分、脑缺血再灌注后p38MAPK的表达变化研究第三部分、抑制p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用研究第一部分：小鼠脑缺血再灌注模型的建立[目的]饲养小鼠,小鼠基因型鉴定,建立全脑缺血再灌注模型,观察存活率。[方法](1)在SPF级动物房饲养小鼠,取小鼠鼠尾提取DNA,经PCR扩增、凝胶电泳、凝胶成像系统图像采集后确定小鼠基因型,鉴定需要的小鼠基因型,进行分类并规模繁殖。(2)应用BCCAO法(bilateral common carotid artery occlusion)制作小鼠全脑缺血再灌注模型,其具体步骤如下：各组小鼠鼠术前禁食12h,禁饮4h,以1%戊巴必妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠,80mg/kg体重,注射麻醉后注意密切观察实验小鼠的自主呼吸,等待翻正反射消失后,仰卧位固定于自制的鼠板上,在解剖显微镜下进行操作,沿着颈部中线正中切开,钝性分离肌肉及结缔组织,分离出双侧颈总动脉并埋线,操作过程避免损伤迷走神经,用无菌丝线依次结扎双侧颈总动脉,观察小鼠的生命体征,如小鼠的呼吸和心跳正常,20mmin再灌注后即可缝合各层肌肉和皮肤,手术创口喷洒并术后肌注庆大霉素预防感染,术中用电热取暖器,以保持体温,术后单笼饲养防止交叉感染。假手术组只分离肌肉及结缔组织,暴露双侧颈总动脉后缝合切口。(3)各组实验小鼠处理后,统计各组的存活率,制作存活率曲线。[结果](1)PCR扩增产物电泳,用凝胶成像系统进行检测拍照。对照DNAmarker有328bp、195bp两条条带的为转基因p38KI/+小鼠,仅有195bp条带的为野生型C57BL/6小鼠(WT),参照基因鉴定结果进行小鼠分笼,单独饲养。(2)缺血再灌注模型制备后的一般情况。假手术组：术后几天恢复后小鼠精神状态好,自主活动多,行动敏捷,各种反应迅速,进食饮水正常。缺血再灌注模型组：小鼠术后多数精神萎靡,反应迟钝,活动量减少,进食进水量也明显减少,行动迟缓；小部分小鼠会出现活动增多,烦躁不安,行走不稳等表现,而且小鼠的自洁能力下降,毛发变稀疏、干枯、竖毛或是缺乏光泽度,偶见有小鼠短暂性阵发性惊厥发作。(3)SHAM组小鼠存活率100%,转基因p38KI/+小鼠生存率较WT小鼠缺血再灌注模型组有所提高。[结论]利用PCR成功鉴定了转基因小鼠的基因型,利用BCCAO法制作I/R模型,并表现了一些症状。基因型小鼠的获得,全脑缺血再灌注后小鼠损伤。第二部分：脑缺血再灌注后p38MAPK的表达变化研究[目的]建立小鼠全脑脑缺血再灌注模型,观察损伤后p38 MAPK在不同时间的表达变化及对应时间点凋亡相关蛋白的表达变化,同时在不同时间点进行神经功能缺损研究和组织形态学研究,以进一步确定研究内容和时段的变化情况。[方法](1)应用两血管法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立小鼠全脑缺血再灌注模型,将约三月龄雄性鼠随机分成假手术组、缺血再灌注模型组(I/R组),应用蛋白印迹Western blot)法检测小鼠海马区p38MAPK磷酸化水平变化。确定变化时间点后进行p-p38和c-caspase-3表达变化研究。(2)小鼠进行BCCAO造模后,分别在1d、3d、5d等几个时间点进行TTC染色,观察缺血情况。计算缺血面积比和梗死体积比。(3)再灌注后NDS评分并采用改良NSS评分法(18分制)对小鼠造模1d,3d,5d,7d后的进行神经功能缺损评估。用美国弗尼吉亚评分法在造模3d前对小鼠进行训练,缺血前1h记录基础值,造模后1d、3d评分,分别测两次记录时间,取均值。(4)取雄性C57小鼠随机分为3组,每组各6只,造模后,分别于造模后1d和3d进行生理盐水、多聚甲醛灌注后取脑,切片后用TUNEL染色法计算缺血再灌注组海马CA1区凋亡的阳性细胞数并计算凋亡指数,分析凋亡指数的变化情况。[结果](1)经western blot分析,发现3d实验组分别比1d、5d和7d实验组后p38蛋白的表达量较高。进而选取3d时间点进行研究,得知I/R模型组p-p38蛋白和SHAM组相比表达升高(p0.05)。I/R模型组c-caspase-3和SHAM相比表达升高(p0.05)。(2)与SHAM组相比,1d(55.344±3.325,p0.05)比3d(44.047±2.099)和5d(34.985±5.435)的梗死体积比更大,缺血相对严重。(3)脑卒中指数NDS评分中,I/R模型组比SHAM组分值高。改良NSS评分中模型组1d、3d、5d和7d比SHAM组分值高。弗吉尼亚评分法中,与SHAM组相比,模型组分值高,有显著差异(p0.05)。(4)TUNEL染色后,模型组3d后CA1区凋亡指数与SHAM组有显著差异(p0.05),但1d后CA1区的凋亡指数与SHAM无显著差异(p0.05).[结论]小鼠脑缺血再灌注3d后相关蛋白因子p38表达量明显升高,相应凋亡蛋白因子caspase3升高,出现凋亡。TUNEL染色结果表明实验组3d后发生了明显细胞凋亡。TTC染色1d后缺血梗死体积最显著。NDS评分结果、NSS评分和弗吉尼亚评分法评分结果一致,实验组与SHAM组差异明显。表明脑缺血再灌注后小鼠神经功能发生了缺损。第三部分：抑制p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用研究[目的]探讨p38MAPK抑制在脑缺血再灌注中的保护作用。[方法](1)将三月龄雄性C57小鼠随机分成假手术组、I/R模型组,加入转基因p38KI/+小鼠全脑缺血造模后做为I/R+KI模型组,应用两血管法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立全脑缺血模型。应用蛋白印迹(Western blot)法检测小鼠海马区p38 MAPK(p-p38/p38)磷酸化水平变化及凋亡蛋白caspase-3表达(c-caspase3/caspase3)变化情况。(2)小鼠进行BCCAO造模后,在1d进行TTC染色,观察缺血情况计算缺血面积和梗死体积。(3)造模后NDS评分(25分制)并采用改良NSS评分(18分制)对小鼠造模Id,3d,5d,7d后的情况进行评估。用美国弗尼吉亚评分法在造模3d前对小鼠进行训练,缺血前1h记录基础值,造模后1d、3d评分,分别测两次记录时间,取均值。(4)取雄性C57小鼠和转基因p38KI/+小鼠随机分为3组,每组各6只。取雄性C57小鼠和转基因p38KI/+小鼠各5只造模后,分别于造模后72h进行生理盐水、多聚甲醛灌注后取脑,用TUNEL染色法计算各组海马CA1区凋亡的阳性细胞数,并计算凋亡指数。[结果] (1)/R+KI模型组和假手术组、I/R模型组相比p38MAPK表达(p-p38/p38)均降低,均有显著差异(p0.05)。I/R+KI模型组和I/R模型组相比caspase-3表达(c-caspase3/caspase3)降低,有显著差异(p0.05)。(2)I/R模型组和I/R+KI模型组相比TTC梗死体积减少,有显著差异(p0.05)。(3)脑卒中指数评分中,I/R模型组(12±1.414)比I/R+KI模型组(7.75±1.500)分值高。改良NSS评分对假手术组、I/R模型组和I/R+KI模型组进行评分。I/R模型组1d、3d、5d和7d比I/R+KI模型组、3d、5d和7d分值高,有显著差异(p0.05)。弗吉尼亚评分法中,I/R模型组比I/R+KI模型组分值高,差异显著(p0.05)。(4)TUNEL染色后SHAM组海马细胞核膜完整,核仁清楚,偶可见退变锥体细胞,而I/R模型组和I/R+KI模型组核膜解体,染色质浓缩、边缘化,胞膜有小泡状形成、染色质分割成块状等,I/R模型组3d后CA1区凋亡的阳性细胞数和凋亡指数与I/R+KI模型组有显著差异,(p0.05)。[结论]I/R+KI模型组和I/R模型组相比,p38MAPK抑制后蛋白表达降低,凋亡相关蛋白caspase3表达降低。TUNEL染色结果表明I/R+KI模型组细胞凋亡和I/R模型组相比明显减少。I/R+KI模型组TTC梗死体积减少。改良的神经功能评分、NSS评分和弗吉尼亚评分法结果一致。说明p38 MAPK被抑制后,神经功能得到修复,有保护作用。
【关键词】：转基因小鼠鉴定 小鼠全脑缺血再灌注损伤 存活率曲线 p-p38 c-caspase-3 TTC 梗死体积 行为学评分 TUNEL 转基因p38~(KI/+)小鼠 p-p38表达 行为学 凋亡 保护作用
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743
【目录】：

• 缩略词表(以字母顺序排列)6-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-19
• 第一部分、小鼠脑缺血再灌注模型的建立19-35
• 前言19-20
• 材料与方法20-24
• 结果24-25
• 讨论25-30
• 参考文献30-35
• 第二部分、脑缺血再灌注后p38MAPK的表达变化研究35-62
• 前言35-36
• 材料与方法36-46
• 结果46-51
• 讨论51-55
• 参考文献55-62
• 第三部分、抑制p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用研究62-84
• 前言62-63
• 材料与方法63-70
• 结果70-76
• 讨论76-79
• 参考文献79-84
• 全文总结84-85
• 综述85-95
• 参考文献92-95
• 本课题获以下基金支持95-96
• 攻读学位期间获得的学术成果96-97
• 致谢97

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王宇歆;马涛;李凤娟;杨成民;;缺血再灌注损伤机制及其对策的初步探讨[J];中国输血杂志;2010年S1期

2 陶平;雌激素防治缺血再灌注损伤的研究现状(文献综述)[J];国外医学.外科学分册;2003年05期

3 胡佳乐;血管性缺血再灌注损伤的基础与临床[J];海军医学杂志;2003年03期

4 怡悦;续命汤预防脑缺血再灌注损伤[J];国外医学(中医中药分册);2005年05期

5 谢明剑,薛伟新,岑家福;脑缺血再灌注损伤的中医药研究概况[J];华夏医学;2005年05期

6 鲁力;张俐;;骨骼肌缺血再灌注损伤机制研究进展[J];中国中医骨伤科杂志;2005年06期

7 文静;钟森;董继萍;陈丽娜;;脑缺血再灌注损伤中医药防治研究进展[J];中国中医急症;2007年06期

8 王燕荣;爱民;谢军;周建秀;李兰诚;丹丹;;蒙药防治缺血再灌注损伤的研究进展[J];中国民族医药杂志;2007年08期

9 张帮健;刘进;;抗坏血酸在缺血再灌注损伤中的保护机制[J];实用医院临床杂志;2009年05期

10 徐辰;李润平;;氢在治疗缺血再灌注损伤的研究进展[J];基础医学与临床;2010年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王宇歆;马涛;李凤娟;杨成民;;缺血再灌注损伤机制及其对策的初步探讨[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集（摘要篇）[C];2010年

2 吴艳;李春英;贾旭峰;何颖;;椒苯酮胺对脑缺血再灌注损伤的保护作用[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年

3 莫书荣;李德剑;;诺迪康对离体豚鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用[A];中国生理学会第五届全国心血管、呼吸和肾脏生理学学术会议论文摘要汇编[C];2005年

4 朱贤富;;脑缺血再灌注损伤机制的研究现状[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

5 于吉人;严盛;刘小孙;郑树森;;尿胰蛋白酶抑制剂减轻移植肠的缺血再灌注损伤[A];2004年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2004年

6 黄贤华;黄常亮;宋微微;方伟;杨芳炬;;迎春花对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用[A];第十届全国中药药理学术会议论文集[C];2007年

7 刘德强;赵德化;盛宝恒;;呋喃二氢吡啶Ⅰ对离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用[A];第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C];1990年

8 刘建修;;缺血再灌注损伤发生机制及防治最新进展[A];江西省第四次中西医结合心血管学术交流会论文集[C];2008年

9 黄唯佳;陈寿权;李惠萍;程俊彦;赵初环;李章平;王明山;王万铁;王卫;;家兔脑缺血再灌注损伤时血栓素B_2/6-酮-前列腺素F_(1α)的变化及醒脑静的保护作用[A];2005急诊医学学术研讨会暨《中华急诊医学杂志》第四届组稿会论文汇编[C];2005年

10 高立建;谢荣爱;田建会;;四氢生物喋呤在新西兰兔缺血再灌注损伤中的保护作用[A];中国心脏大会（CHC）2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 衣晓峰　岳金凤 记者　 李丽云;我科学家揭示脑缺血再灌注损伤奥秘[N];科技日报;2007年

2 衣晓峰　靳万庆;静脉麻醉药保护脑缺血再灌注损伤机制被揭示[N];中国中医药报;2007年

3 ;抗呆I号可恢复脑缺血再灌注损伤细胞功能[N];中国中医药报;2004年

4 张中桥;黄芪对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[N];中国医药报;2006年

5 张中桥;黄芪对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[N];中国中医药报;2006年

6 张茨;扭转的睾丸切还是保——医生有新说[N];健康报;2005年

7 燕海霞 王忆勤 李福凤;川芎嗪在肾脏病中应用前景看好[N];中国医药报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 黄薇园;功能MRI动态监测大鼠急性缺血性脑卒中缺血再灌注损伤及其与预后相关的实验研究[D];复旦大学;2014年

2 王震;不同药物干预心、肾缺血再灌注损伤的作用与机制研究[D];第三军医大学;2015年

3 凡进;自噬在脊髓缺血再灌注损伤过程中作用机制的研究[D];南京医科大学;2013年

4 杨伟;miR-208a在心肌缺血再灌注损伤中作用及相关机制的研究[D];昆明医科大学;2016年

5 姚勇刚;MG53对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D];第三军医大学;2016年

6 侯帅;脑缺血再灌注损伤中线粒体缝隙连接蛋白43对神经血管单元的保护作用及丹参多酚酸干预[D];吉林大学;2016年

7 张小英;兔睾丸缺血再灌注损伤及其保护措施的机理研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

8 尚宪荣;益气活血化瘀法治疗下肢缺血再灌注损伤的临床研究[D];北京中医药大学;2014年

9 阮永乐;一氧化碳对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其新机制研究[D];华中科技大学;2013年

10 林生;右美托咪定对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制[D];山东大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王富明;针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠外周血清SOD、MDA、miRNA-126及VEGF表达的影响[D];北京协和医学院;2015年

2 赵层闪;化浊解毒活血通络法对脑缺血再灌注损伤大鼠模型VEGF表达及微血管密度的影响[D];河北医科大学;2015年

3 刘宗炎;辛芍组方对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D];贵阳医学院;2014年

4 陈亚楠;大鼠肾脏缺血前灌洗对肾脏缺血再灌注损伤的影响作用[D];遵义医学院;2016年

5 李敏;不同剂量重组人粒细胞集落刺激因子对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[D];山西医科大学;2016年

6 查婷婷;血氧水平依赖磁共振成像评价兔肾缺血再灌注损伤的实验研究[D];苏州大学;2016年

7 邵静波;TcPO_2评估兔下肢缺血再灌注损伤程度的应用及价值[D];苏州大学;2016年

8 叶维韬;体素内不相干运动扩散加权成像在兔肝脏缺血再灌注损伤中的应用[D];南方医科大学;2016年

9 吕少君;右美托咪定对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响[D];南方医科大学;2016年

10 刘远玲;GSK-3β在大鼠脑缺血再灌注损伤时对Nrf2的调控作用研究[D];重庆医科大学;2016年

，

本文编号：1000907