AQP4和MMPs在常压氧减轻大鼠缺血性脑水肿中的作用研究

发布时间：2017-10-10 19:22

  本文关键词：AQP4和MMPs在常压氧减轻大鼠缺血性脑水肿中的作用研究

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【摘要】：目的基于前期研究“早期吸氧能够改善急性缺血性脑卒中大鼠的神经功能”的结论,探讨水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)和金属基质蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)在常压氧(Normobaric oxygen,NBO)减轻大鼠缺血性脑水肿中的作用,以期为急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)患者有效吸氧提供重要的实验依据。方法1对象与分组:于河南省动物中心购买健康雄性SPF(Specified Pathogen Free)级SD(Sprague Dawley)大鼠75只,饲养一周,鉴定合格后,按体重编号,以随机数字表法分为:(1)假手术组25只(不做造模处理,只做相应的解剖、分离、挂线和缝合,吸入空气);(2)模型组25只(大脑中动脉缺血再灌注后吸入空气);(3)吸氧组25只(大脑中动脉缺血再灌注后吸入61%NBO)。每组根据观察时间点不同随机分为再灌注0.5h、3h、6h、12h及24h五个亚组(n=5)。2造模:参照Zea Longa线栓法,吸氧组及模型组大鼠采用右侧大脑中动脉缺血后再灌注模型,术前12h禁食不禁水,予充足水分。缺血2h后参照Zea Longa 5级4分制标准进行评分,得分1分~3分者,视为造模成功。评分结束后乙醚麻醉大鼠,抽出线栓实现再灌注。随时补充大鼠以保证各组数量充足。3干预:将吸氧组大鼠置于自制封闭氧舱(50cm×30cm×30cm):该氧舱侧面各有一个小孔(1cm×1cm)与外界相通,一侧连接氧气和氮气瓶;另一侧与测氧仪相连,来监测氧舱氧气浓度,以便及时调节氧气和氮气,确保盒内氧气浓度达到(61±2)%。假手术组及模型组大鼠吸入空气。4指标检测:评估大鼠神经功能缺损评分;荧光定量PCR(Q-PCR)检测大鼠脑组织中AQP4 m RNA表达水平;免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测大鼠脑组织中AQP4蛋白的表达;明胶酶谱法检测大鼠脑组织中MMP2及MMP9的活性。5统计学方法:神经功能缺损评分差异比较采用两独立样本秩和检验及配对资料的符号秩和检验;三组间AQP4 m RNA及蛋白表达,MMPs活性比较采用析因设计方差分析;两两比较采用SNK检验。检验水准α=0.05。结果1大鼠造模:成功制备MCAO再灌注大鼠模型时,大鼠均出现神经功能缺损的表现;肉眼观察新鲜脑组织缺血部位发白;且脑组织缺血部位染色较浅。2大鼠神经功能缺损评分:吸氧后,吸氧组大鼠神经功能缺损评分与吸氧前相比,在再灌注12h(P=0.031)及24h(P=0.015)时有不同程度的降低;与模型组相比,再灌注0.5h(P=0.042)、3h(P=0.014)、6h(P=0.042)、12h(P=0.031)及24h(P=0.015)时评分也有所下降;假手术组大鼠表现正常,神经功能缺损评分为0分。3大鼠脑组织形态:肉眼观察新鲜脑组织形态,假手术组大鼠脑组织形态无明显改变;吸氧组与模型组大鼠脑组织于再灌注0.5h仅见个别血管充血;再灌注3h、6h、12h至24h,大鼠右脑缺血部位发白,面积逐渐增大,24h病变组织变软,脑组织水肿明显。吸氧组与模型组相比,肉眼观察缺血性脑水肿体积较小。HE染色结果显示:假手术组大鼠神经细胞数目及形态改变不明显;模型组中,大鼠脑缺血再灌注0.5h、3h及6h后,脑组织缺血部位着色较浅,神经细胞减少,星形胶质细胞足突水肿;再灌注12h及24h,大鼠脑组织缺血区域神经细胞和小血管周围可见空隙,提示缺血性脑水肿。吸氧组大鼠脑组织水肿体积及神经细胞坏死面积较模型组小,神经细胞数目较模型组多。4 Q-PCR检测结果显示:析因设计方差分析三组大鼠脑组织中AQP4m RNA表达,组别主效应存在差异(F组别=1340.962,P组别0.001),时间主效应存在差异(F时间=104.569,P时间0.001),组别和时间之间存在交互作用(F组别×时间=27.218,P组别×时间0.001)。与假手术组相比,模型组与吸氧组大鼠脑组织缺血再灌注各时间点AQP4 m RNA表达水平明显增加(P0.001);与模型组相比,吸氧组大鼠脑组织再灌注3h(P=0.011)、6h(P=0.008)、12h(P=0.019)及24h(P=0.014)时AQP4 m RNA表达水平降低。5 Western blotting检测结果显示:析因设计方差分析三组大鼠脑组织AQP4蛋白表达,组别主效应存在差异(F组别=7802.486,P组别0.001),时间主效应存在差异(F时间=2562.095,P时间0.001),组别和时间之间存在交互作用(F组别×时间=652.677,P组别×时间0.001)。假手术组大鼠脑组织中AQP4蛋白表达最低。再灌注3h、6h、12h及24h,模型组与吸氧组大鼠脑组织中AQP4蛋白表达比假手术组相比明显升高(P0.001);再灌注6h、12h及24h,吸氧组AQP4蛋白表达与模型组相比较低(P0.001)。6明胶酶谱法结果显示:析因设计方差分析三组大鼠脑组织中MMP2活性,组别主效应存在差异(F组别=439.644,P组别0.001),时间主效应存在差异(F时间=1622.719,P时间0.001),组别和时间之间存在交互作用(F组别×时间=433.366,P组别×时间0.001)。与假手术组相比,脑缺血再灌注3h时,模型组及吸氧组大鼠脑组织中MMP2活性增强(P0.001)。析因设计方差分析三组大鼠脑组织中MMP9活性,组别主效应存在差异(F组别=1728.421,P组别0.001),时间主效应存在差异(F时间=1936.229,P时间0.001),组别和时间之间存在交互作用(F组别×时间=492.343,P组别×时间0.001)。与假手术组相比,模型组及吸氧组再灌注6h时,MMP9活性增强,随后呈曲线上升,直至再灌注24h达高峰。再灌注6h(P=0.001)、12h(P=0.001)及24h(P=0.006),与模型组相比,吸氧组MMP9活性降低。结论1 NBO能够改善MCAO再灌注大鼠神经功能,减轻缺血性脑水肿;2 NBO能够抑制MCAO再灌注大鼠脑组织AQP4分子表达,降低MMP9的活性;3 NBO抑制AQP4分子表达,降低MMP9的活性可能是NBO减轻缺血性脑水肿的机制之一。
【关键词】：常压氧 脑缺血再灌注 缺血性脑水肿 AQP4 MMPs
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R473.74
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-17
• 缩略词表（Abbreviation）17-18
• 引言18-27
• 1 研究背景18-25
• 1.1 缺血性脑水肿机制的研究现状19-23
• 1.2 缺血性脑水肿主要治疗途径23
• 1.3 NBO在AIS中的研究现状23-25
• 1.4 研究问题的提出25
• 2 研究目的及意义25-27
• 2.1 研究目的25-26
• 2.2 研究意义26-27
• 材料与方法27-39
• 1 实验材料27-29
• 1.1 实验对象27
• 1.2 主要试剂与耗材27-28
• 1.3 主要仪器设备28
• 1.4 主要溶液配制28-29
• 2 实验方法29-39
• 2.1 动物模型制备29-30
• 2.2 实验分组30-31
• 2.3 干预方法31
• 2.4 脑组织标本的制备31-32
• 2.5 神经功能缺损评分32
• 2.6 脑组织形态改变32-33
• 2.7 Q-PCR检测脑组织中AQP m RNA的表达33-35
• 2.8 Western Blotting检测脑组织中AQP4蛋白的表达35-37
• 2.9 明胶酶谱法检测脑组织中MMP2及MMP9的活性37
• 2.10 数据处理与统计分析37-38
• 2.11 质量控制38
• 2.12 伦理原则38-39
• 实验结果39-50
• 1 大鼠造模39-40
• 2 大鼠神经功能缺损评分40-41
• 3 大鼠脑组织形态改变41-43
• 3.1 大鼠脑组织形态41-42
• 3.2 HE染色42-43
• 4 大鼠缺血性脑水肿作用机制的研究结果43-50
• 4.1 Q-PCR检测大鼠脑组织中AQP4 m RNA的表达43-45
• 4.2 Western Blotting检测大鼠脑组织中AQP4蛋白的表达45-47
• 4.3 明胶酶谱法检测大鼠脑组织中MMP2及MMP9的活性47-50
• 讨论50-59
• 1 AIS动物模型的选择与建立50
• 2 NBO对MCAO再灌注大鼠神经功能的影响50-51
• 3 NBO对MCAO再灌注大鼠缺血性脑水肿的作用51-58
• 3.1 NBO对大鼠脑组织形态的影响52-53
• 3.2 AQP4在NBO减轻大鼠缺血性脑水肿中的作用53-55
• 3.3 MMPs在NBO减轻大鼠缺血性脑水肿中的作用55-57
• 3.4 AQP4和MMP9在NBO减轻大鼠缺血性脑水肿中的相互作用57-58
• 4 研究的创新性、局限性及展望58-59
• 4.1 研究的创新性58
• 4.2 研究的局限性58
• 4.3 研究的展望58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-69
• 综述69-76
• 参考文献73-76
• 附录76-77
• 个人简历77-79
• 1 个人信息77
• 2 在研期间研究成果及参与项目情况77-78
• 2.1 论文发表或录用情况77
• 2.2 参与申请实用新型专利1项77
• 2.3 参与省级科研项目3项77-78
• 3 获奖情况78-79
• 致谢79-80

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本文编号：1008146