小鼠鞘内注射rAAV9载体介导中枢神经系统的广泛转基因表达

发布时间：2017-10-17 15:28

  本文关键词：小鼠鞘内注射rAAV9载体介导中枢神经系统的广泛转基因表达

  更多相关文章： rAAV9 腰椎穿刺 鞘内注射 基因治疗 中枢神经系统 免疫反应

【摘要】：目的:通过导入治疗性基因来治疗人类疾病的思想始于二十世纪七十年代,随后发现病毒可作为基因治疗的载体。理想的病毒载体必须具备三个特性:一是对目标组织的高亲和性和高转导效率及对非目标细胞、组织和器官的低转导效率。二是该病毒载体可以在一段时间内以持续的、具治疗作用的水平表达。第三也是最重要的,就是病毒载体相关的副作用如致病性及机体免疫反应最小。腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是依赖病毒属细小病毒科的一种。细小病毒属是一种非自主性病毒,需要与其他病毒共同感染以使其表达,并且无致病性,它的这些生物特性大大降低了AAV作为基因治疗载体的副作用。重组腺相关病毒(recombinant AAV,r AAV)因其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,目前已广泛应用于基础及临床研究。r AAV能介导目的基因在中枢神经系统(central nervous system,CNS)的表达。r AAV9为r AAV家族中的一员,有研究证实r AAV9能透过血脑屏障,并在脑和脊髓内长时间表达目的基因,故在中枢神经系统疾病的基因治疗中r AAV9的优势明显。基因治疗的关键是转基因要被输送到足够数量的疾病受累细胞中。不同的注射方式所引起的转基因表达的分布及所需病毒量不同。实质内注射可转导注射局部,但对于病变范围累及脊髓全长、脑干及皮层的肌萎缩侧索硬化并不适用。静脉内注射r AAV9虽可转导新生小鼠CNS的广泛区域,但对成年小鼠CNS转导效率较低,且存在靶向性不强、载体需求量大及潜在的安全性问题。脑脊液内注射r AAV载体没有血脑屏障的阻碍,直接与CNS接触。主要途径包括脑室内注射、小脑延髓池注射和鞘内注射,其中鞘内注射对脊髓的转导更具优势,是没有创伤的基因治疗给药方法。有研究者应用小鼠鞘内置管注射或直接腰椎穿刺的方法研究了r AAV载体介导的转基因表达,但存在的共同问题是不同个体间转导程度和范围变异较大,作者认为与操作者置管及注射成功与否的不确定性有关。直接腰穿鞘内注射相对于鞘内置管更安全、无创且简便可行,但同时存在小动物固有的技术难度。操作者直接鞘内注射的成功程度不同将导致个体间转导效率及临床效果的巨大差异。因此,需要一种无创、简单、可控性强的广泛CNS转导方法。本实验针对小鼠腰椎穿刺鞘内注射的盲目性,建立了对鞘内注射效果的简单、有效的即时评估系统。利用改良的小鼠直接鞘内注射法将r AAV9-CB6-EGFP注射入椎大池部位的脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中,研究r AAV9载体介导的中枢神经系统转导范围、效率及细胞类型。方法:1小鼠鞘内注射法雄性8-10周龄FVB小鼠18只,分为对照组6只及实验组12只。小鼠清醒状态下分别腰椎穿刺法注射PBS或r AAV9-CB6-EGFP载体(4x1010GC)8ul(含1%利多卡因),记录注射后小鼠四肢无力及瘫痪情况,三周后新鲜或4%多聚甲醛灌流固定取材。2免疫组织化学法4%多聚甲醛固定的脑和脊髓组织经振动切片机切成厚20μm切片,0.01M PBS溶液漂洗;3%H2O2浸泡,封闭组织内源性过氧化物酶;0.3%triton X-100穿孔;10%马血清室温封闭,分别加入抗GFP、抗GFAP及抗Iba1抗体,二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素依次孵育后,DAB染色,捞片,脱水,透明及封片。Olympus BX51显微镜观察及照相。3免疫荧光法4%多聚甲醛固定的脊髓组织经30%蔗糖/PBS溶液浸泡过夜至组织沉底。冷冻环境下使用包埋剂OCT包埋组织,用冰冻切片机切成厚20μm切片,经漂洗、穿孔、封闭、一抗(anti-GFP,anti-Neu N,anti-GFAP,anti-Iba1和anti-APC)、荧光二抗孵育并再次PBS漂洗后,抗荧光衰减封片剂封片,Olympus FV1000激光共聚焦显微镜观察及照相。4蛋白免疫印迹小鼠经麻醉后,新鲜取腰髓、颈髓、脑干、小脑、海马、皮层和嗅球,液氮速冻后,-80℃保存待用。提取组织总蛋白,BCA法测蛋白浓度。蛋白上样30ug,SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,室温脱脂奶粉封闭后,分别加一抗4℃摇床过夜。次日,加入荧光二抗,洗膜,Odyssey红外扫描成像系统扫膜并分析结果。5统计分析计量资料用x±s表示,采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计处理。不同部位表达水平的比较采用单因素方差分析。P0.05为差异显著,有统计学意义。结果:1根据小鼠鞘内注射后短暂肌无力表现分为5级:1分,双后肢轻度无力。2分,双后肢中度无力,伴步态异常。3分,双后肢瘫痪。4分,双后肢瘫痪伴双前肢无力。5分,四肢瘫痪伴呼吸受抑。评分4-5分为注射成功。18只注射的小鼠中有14只注射成功,成功率为77.8%。2鞘内注射PBS组小鼠脊髓GFP免疫组织化学染色呈阴性,r AAV9载体注射组小鼠脊髓GFP免疫组化染色呈不同程度阳性,与注射后短暂肌无力评分呈明显正相关。成功注射的小鼠脊髓GFP表达明显强于注射失败小鼠,因此通过注射后肌无力表现能预测中枢神经系统转导效果。3小鼠鞘内注射r AAV9载体后,脊髓全长均有转基因表达,以前角、后角、前根发出区及后根传入区域为著。脑干、小脑及前脑均可见不同程度、散在的转基因表达。GFP阳性细胞以胶质细胞为主,可见脊髓前角神经元、小脑蒲肯野细胞、皮层及海马神经元的转基因表达。4免疫荧光显示神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞均存在GFP表达。5免疫印迹显示GFP在腰髓表达最高,其次是颈髓、嗅球、海马和皮质,脑干和小脑转基因表达较低。6成功转导r AAV9载体的小鼠腰髓未见明显小胶质细胞和星形胶质细胞增生,与对照组相比无明显差异。结论:小鼠鞘内注射r AAV载体简便、无创,通过加入利多卡因可有效地预测中枢神经系统的转导效率;r AAV9载体经腰椎穿刺注入CSF后,在脊髓全长及脑组织内转基因表达范围广泛,且不引起明显的神经炎性反应,在中枢神经系统疾病的基因治疗中具有潜在的应用前景。
【关键词】：rAAV9 腰椎穿刺 鞘内注射 基因治疗 中枢神经系统 免疫反应
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文缩写12-13
• 前言13-14
• 材料与方法14-22
• 结果22-23
• 附图23-28
• 讨论28-30
• 结论30
• 参考文献30-33
• 综述 腺相关病毒介导的神经营养因子表达对肌萎缩侧索硬化基因治疗 的研究进展33-44
• 参考文献39-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨辉;向钱;李宁;;食品中转基因表达蛋白的危险性评估[J];中国食品卫生杂志;2010年02期

2 康禹,高占成,虞有志,尚颖,何俊里,张一,何权瀛;腺病毒介导的β-半乳糖苷酶在小鼠气道上皮的转基因表达[J];中国医药导刊;2001年06期

3 孙汉堂;肖明振;吴补领;朱庆林;费俭;;牙本质涎蛋白转基因小鼠的建立和转基因表达的初步分析[J];上海口腔医学;2006年02期

4 余惠明,王天云;人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响[J];第四军医大学学报;2005年14期

5 徐东平;吴易元;陈金栋;遇珑;钟梅;惠依群;翟红;;入 IL-2转基因表达及对小鼠黑色素瘤生长的影响[J];中国医学科学院学报;1993年01期

6 王天云;韩忠敏;杨献军;董忠生;王清义;;MAR提高稳定转化的CHO细胞转基因表达[J];基础医学与临床;2008年11期

7 陈汉源;控制转基因表达的细胞和时序专一性[J];第一军医大学学报;1997年02期

8 刘惠彬,江一平;转基因表达的四环素调控系统[J];福建医科大学学报;2005年01期

9 孙敬方;时空表达可控的转基因动物模型调控体系的研究[J];中国实验动物学报;2005年02期

10 胡萍;高占成;;mIFN-γ转基因表达对小鼠肺纤维化治疗的作用机制[J];山东医药;2009年28期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 张蕾;程巳雪;张先正;卓仁禧;;以聚丙三醇为核枝接PEI的高支化聚合物实现高效转基因表达[A];全国博士后微纳米粉体与材料应用技术交流会论文集[C];2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 张石盼;小鼠鞘内注射rAAV9载体介导中枢神经系统的广泛转基因表达[D];河北医科大学;2015年

2 冯婧娴;人工核酶核糖开关调控转基因表达的性能及优化[D];华侨大学;2015年

3 郑娴娴;辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率[D];安徽医科大学;2010年

4 刘惠彬;CMV-EGFP转基因小鼠的制备及转基因表达情况的观察[D];福建医科大学;2005年

5 牛卫品;线虫特定神经元的转基因表达[D];华中科技大学;2011年

，

本文编号：1049607