联合转录因子、GLP-1和Gastrin在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用机制

发布时间：2017-10-19 13:23

  本文关键词：联合转录因子、GLP-1和Gastrin在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用机制

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【摘要】：糖尿病作为一种慢性代谢性疾病严重影响着人们的健康,其主要病因为胰岛素分泌相对和(或)绝对不足。胰岛移植曾被认为是根治糖尿病的有效疗法,但因供体来源不足及免疫排斥等限制其在临床工作中的应用。目前非β细胞诱导分化为胰岛样细胞(insulin-producing cell,IPCs)移植治疗糖尿病成为了世界范围内关注的焦点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞。BMSCs多向分化、取材方便、体外易于培养及可自体移植等特性,使其成为诱导分化靶细胞的首选。在胰岛β细胞分化发育的过程中,转录因子起着至关重要的作用,其中最关键的转录因子主要包括胰十二指肠同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox1,Pdx-1)、神经元素3(Neurogenin 3,Ngn3)和V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A,Maf A)等。Pdx-1为胰腺发育过程中第一个关键转录因子,其作用主要是维持胰腺前体细胞的发育,参与胰腺分化发育的全过程。外源性导入Pdx-1基因不仅可成功诱导BMSCs分化为IPCs,而且可促进下游胰岛素相关基因的表达。Ngn3是胰腺内分泌细胞发育的关键因子,其控制着胰腺内分泌祖细胞的分化方向,外源表达的Ngn3可促进胰腺导管细胞向IPCs分化。Maf A是唯一特异存在于胰岛β细胞的转录因子,其主要功能是在Pdx-1基因表达的前体下反式激活胰岛素相关基因的表达,参与胰腺β细胞的形成以及维持胰腺β细胞的功能。研究发现转录因子联合后可诱导BMSCs转分化为永久编码的IPCs。胰岛β细胞的再生和生物功能的维持还需要一些胃肠激素的参与,例如胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和胃泌素(Gastrin)。GLP-1是肠粘膜L细胞分泌的胃肠激素,其主要是通过促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌,刺激胰岛β细胞的增殖和分化并抑制其凋亡,进而保护β细胞并增加β细胞的数量。近年来,研究发现GLP-1还可以在体外诱导干细胞分化为IPCs,然而其作用机制尚未阐明。胃泌素是人体内另外一种重要的胃肠激素,其主要是由消化道黏膜中的G细胞分泌,研究发现其可促进糖尿病鼠胰腺组织体积增加以及胰岛β细胞数量的增加。因此,我们推测GLP-1联合胃泌素可进一步促进IPCs分化,且移植后可降低糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠的血糖。为此,本实验开展以下研究。第一部分大鼠BMSCs的分离培养及腺病毒载体的构建目的分离、培养、鉴定大鼠BMSCs,构建p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒载体。方法1.大鼠BMSCs的分离及培养:采用全骨髓贴壁法分离、培养原代大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定大鼠BMSCs表面标志物CD34、CD44和CD105,CCK-8测定大鼠BMSCs生长曲线。2.腺病毒载体的构建:p Ad Cherry、p Ad EGFP、p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry、和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒载体购买于上海吉凯基因化学有限公司,包装和扩增均在293T细胞,病毒滴度为10-9-10-10/ml,储存于-80℃冰箱。结果1.原代大鼠BMSCs培养过程中,细胞逐渐由圆形透亮变成长梭形,符合大鼠BMSCs形态特征。流式细胞术鉴定CD34阳性率5%,CD44和CD105阳性率95%,符合大鼠BMSCs表面标志特征。2.生长曲线表明细胞增殖能力良好。腺病毒载体序列符合基因序列。结论1.体外成功分离大鼠BMSCs。2.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒载体构建成功。第二部分体外诱导大鼠BMSCs分化为IPCs目的Pdx-1、Ngn3联合Maf A诱导大鼠BMSCs分化为IPCs,探讨GLP-1和Gastrin进一步诱导IPCs分化的作用机制。方法1.腺病毒载体感染大鼠BMSCs:p Ad Cherry和p Ad EGFP分别以MOI5-100感染大鼠BMSCs,观察荧光及细胞状态确定最佳MOI.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP以最佳MOI单独及联合感染大鼠BMSCs,培养于高糖培养基。未感染组作为对照组。2.感染后细胞鉴定及功能检测(第一阶段):BMSCs分别感染p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry(Pdx-1-Ngn3感染组)、p Ad-Maf A-EGFP(Maf A感染组)、p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP(联合感染组),未感染组作为空白对照(未感染组)。蛋白印记(Western blot)检测感染后细胞中目的基因的表达;双硫腙(DTZ)染色鉴定细胞分泌胰岛素的特性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测感染后细胞不同时期胰岛素的分泌情况;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测感染后细胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK(葡萄糖激酶)、Glucagon(胰高血糖素)、insulin2(胰岛素基因2)m RNA的表达。3.GLP-1和Gastrin诱导联合感染细胞及功能分析(第二阶段):上述联合感染细胞培养于高糖培养基后7天,分别培养于高糖培养基(联合感染组)、高糖培养基含GLP-1(GLP-1诱导组)、Gastrin(Gastrin诱导组)、GLP-1和Gastrin(联合诱导组),酶联免疫吸附法(ELISA)检测诱导染后细胞不同时期胰岛素的分泌情况;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测诱导后细胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK(葡萄糖激酶)、Glucagon(胰高血糖素)、insulin2(胰岛素基因2)m RNA的表达。结果1.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP单独及联合感染的最佳MOI分别为50和30。2.第一阶段:Western blot显示各感染组均有相应的蛋白表达,证实p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP已成功感染大鼠BMSCs。感染后5天感染组细胞开始聚集,7天明显聚集成团,且可被DTZ染成猩红色,证实此时细胞已具备IPCs的特征。ELISA结果显示各组均有胰岛素分泌,联合感染组胰岛素的分泌水平明显优于其他组,各组在感染第0、3、5、7、9天胰岛素分泌水平逐渐提高,且联合感染组升高最为明显(P0.05);RT-PCR结果显示与未感染组相比,感染组Pdx-1、Insulin2、Glucagon及GK基因表达明显上调(P0.05);与Maf A感染组相比,Pdx-1-Ngn3感染组Pdx-1表达上调,联合感染组Pdx-1和Insulin2表达上调,Glucagon表达下调(P0.05);与Pdx-1-Ngn3感染组相比,联合感染组Glucagon表达上调(P0.05),联合感染组GK、Insulin2m RNA的表达明显优于其他诱导组。3.第二阶段:ELISA结果显示各组均有胰岛素分泌,联合诱导组胰岛素的分泌水平明显优于其他组,各组在诱导第0、3、5、7天胰岛素分泌水平逐渐提高,且联合诱导组升高最为明显(P0.05);RT-PCR结果显示:与联合感染组相比,GLP-1诱导组GK、Insulin2 m RNA的表达明显上调(P0.05),联合诱导组Pdx-1、GK、Insulin2 m RNA的表达明显上调(P0.05)。结论1.Pdx-1-Ngn3联合Maf A成功诱导大鼠BMSCs转分化为IPCs。2.GLP-1和Gastrin通过促进GK、Pdx-1和insulin2基因的表达促进IPCs的分化及功能的完善。第三部分IPCs移植治疗T1DM大鼠目的探讨IPCs在体内对T1DM大鼠体重及血糖变化的影响及机制。方法1.T1DM大鼠模型的建立:清洁级SD大鼠,体重220±10g,适应性饲养1周,禁食12h后,给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg。1周后监测随机血糖,3次随机血糖16.7mmol/l则造模成功。2.IPCs移植到T1DM大鼠体内:采用10%水合氯醛按照0.3ml/100g腹腔注射到大鼠体内进行麻醉。俯卧位固定大鼠四肢,备皮后左肾区行长约2cm纵行切口,逐层打开腹腔,将肾脏挑出腹腔,小型镊子夹起肾脏被膜,微量注射器将制备好的细胞悬液注射到肾脏下极。25只T1DM大鼠随机分成5组,即假手术组:左肾被膜下移植10ul PBS;移植组A:左肾被膜下移植联合感染组细胞2×106个;移植组B:左肾被膜下移植Gastrin诱导组细胞2×106个;移植组C:左肾被膜下移植GLP-1诱导组细胞2×106个;移植组D:左肾被膜下移植联合诱导组细胞2×106个;另外5只正常大鼠左肾被膜下移植10ul PBS作为正常对照组。3.监测大鼠体重及空腹血糖变化:移植后,第7,14,21,28天称量各组大鼠的体重并记录,禁食12h后,监测各组大鼠空腹血糖水平并记录。4.腹腔糖耐量试验:移植后28天,各组大鼠禁食12h,按照每公斤体重0.2g 50%葡萄糖给予腹腔注射,并监测注射前及注射后30min,60min,120min血糖。5.肾脏免疫组织化学:行腹腔糖耐量实验后,切除各组大鼠肾脏组织,固定于4%多聚甲醛用于免疫组化检测。结果1.移植后,正常组大鼠体重以每周6-8g增加,而假手术组大鼠体重以每周3-5g减轻,移植组大鼠体重不但没有出现明显的下降,而且有所增加,且以移植组D大鼠体重增加最为显著。假手术组大鼠血糖持续处于高水平,移植组大鼠血糖随时间变化均有下降,尤其以移植组D大鼠血糖下降最为明显。2.腹腔糖耐量试验显示,正常组大鼠血糖在注射葡萄糖后30min达高峰,120min时下降到正常水平;假手术组大鼠血糖在注射葡萄糖后呈现持续升高的状态;移植组大鼠的血糖变化呈现出与正常大鼠相似的先升高再下降的趋势,但在120min时并未下降到空腹水平。3.肾脏的免疫荧光显示,移植组中移植的细胞可存活并分泌胰岛素,且以移植组D细胞的存活数量及胰岛素分泌水平最为显著。结论IPCs移植后不仅可在体内存活而且可以分泌胰岛素,GLP-1联合Gastrin诱导组降糖效果最佳,考虑其机制为联合诱导的IPCs不仅在体内的存活的数量最多,而且分泌胰岛素的水平最为显著。
【关键词】：胰十二指肠同源盒1 神经元素3 V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A 胰高血糖素样肽1 胃泌素 大鼠骨髓间充质干细胞 诱导分化 胰岛样细胞
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要4-10
• Abstract10-20
• 中英文缩略词表20-21
• 引言21-23
• 第一部分 大鼠BMSCs的分离培养及腺病毒载体的构建23-30
• 1 材料23-24
• 2 方法24-26
• 3 结果26-28
• 4 讨论28-29
• 5 结论29-30
• 第二部分 体外诱导大鼠BMSCs分化为IPCs30-44
• 1 材料30-32
• 2 方法32-38
• 3 结果38-43
• 4 讨论43
• 5 结论43-44
• 第三部分IPCs移植治疗DM大鼠44-52
• 1 材料44-45
• 2 方法45-47
• 3 结果47-50
• 4 讨论50-51
• 5 结论51-52
• 参考文献52-54
• 全文小结54-55
• 综述 胰腺转录因子及胃肠激素对干细胞转分化为胰岛样细胞作用研究进展55-67
• 参考文献64-67
• 附录67-77
• 个人简历、在学期间发表的学术论文77-78
• 致谢78

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