盐酸小檗碱对草鱼补体C3作用机理及药代动力学研究

发布时间：2017-10-23 00:01

  本文关键词：盐酸小檗碱对草鱼补体C3作用机理及药代动力学研究

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【摘要】：近年来,免疫学在水产上的研究已成为研究水产动物病害的热点之一,免疫机制的研究为合理有效地防治各类动物疾病提供依据。传统的预防与治疗水产动物疾病以使用抗生素为主,但不良反应多,副作用显著。然而人们发现越来越多的中药不仅具有良好的抗菌和提供免疫力的作用而且副作用少。黄连具有清热解毒及杀菌的功效,其主要化学成分是生物碱,例如,小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱,其中小檗碱含量约6%-10%。已有文献报道黄连可以提高鱼类的免疫力,因此,我们对黄连生物碱进行提取与分离并研究小檗碱对草鱼补体C3作用的机理研究,阐明黄连提高水产类动物免疫力的物质基础,为黄连在水产上的应用与开发提供理论依据本论文的主要内容与结果1、黄连中生物碱的提取分离与鉴定运用高速逆流色谱法(HSCCC),以氯仿-甲醇-0.2 mol/L盐酸作为溶剂体系从黄连的生物碱粗提物中进一步分离制备了4种生物碱类化合物,通过1H NMR和13C NMR核磁波谱技术并结合相关文献报道确定4个化合物分别为小檗碱、巴马汀、表小檗碱及黄连碱。与传统的分离方法相比,高速逆流色谱法(HSCCC)具有分离周期短,溶剂用量少,操作简便快捷,在中药成分分离上具有独特的优势。2、盐酸小檗碱对感染嗜水气单胞菌草鱼存活率的影响实验取体重均匀且健康的草鱼150条,随机分为5组:对照组(NC)、模型组(M)、盐酸小檗碱0.06%组(BBR-L)、盐酸小檗碱0.12%组(BBR-M)、盐酸小檗碱0.24%组(BBR-H)。实验组投喂相应的浓度的盐酸小檗碱饲料,对照组与模型组投喂基础饲料,每天投喂饲料10 g/尾,连续投喂14天后,模型组和实验组腹腔注射0.2 mL嗜水气单胞菌(108 cfu/m L),对照组注射等量的无菌生理盐水。记录草鱼死亡情况,实验重复三次,取三次实验的平均值。结果显示给药组草鱼的存活率分别为50%、70%、73.3%,模型组(M)存活率仅为10%,对照组没有死亡情况。经统计分析,各个药物浓度试验组草鱼存活率均显著提高(p0.01)。表明盐酸小檗碱能提高草鱼的免疫力,且与剂量相关。3、盐酸小檗碱对草鱼非特异性免疫指标的影响本实验取80条体型大小相似的草鱼随机分为4组,每组20条,分别为对照组(nc)、0.06%、0.12%、0.24%盐酸小檗碱给药组,给药组投喂相应的浓度的盐酸小檗碱饲料,对照组投喂基础饲料。各组每天投喂饲料10g/尾,观察草鱼进食和活动情况,在第7天和第14天尾静脉取血,测定草鱼免疫指标补体c3含量、溶菌酶活性、呼吸爆发活性。实验数据使用spss16.0统计软件进行分析,结果以平均值±标准差表示,采用单因素方差分析及lsd对样品进行多重比较。实验结果表明:在第七天,0.12%和0.24%盐酸小檗碱给药组血清中补体c3含量与对照组相比显著性提高(p0.05),溶菌酶活性和呼吸爆发活性均有所上升,但未见显著性差异(p0.05);第14天,各浓度给药组的草鱼补体c3含量均表现显著性提高(p0.05);溶菌酶活性升高,但均未达显著差异(p0.05);0.12%、0.24%盐酸小檗碱给药组呼吸爆发活性升高且具有显著性差异(p0.05),0.06%盐酸小檗碱给药组活性虽有升高,但未见显著差异(p0.05)。表明盐酸小檗碱能提高草鱼的非特异性免疫功能。4、盐酸小檗碱对草鱼补体c3mrna表达的影响随机将80条健康且体型大小相似的草鱼分为4组,分别为对照组、0.06%、0.12%、0.24%盐酸小檗碱给药组。试验组投喂相应的浓度的盐酸小檗碱饲料,对照组投喂基础饲料,每天投喂饲料10g/尾。观察草鱼进食情况和活动情况,喂养14天后,麻醉后杀死,取其肝脏,提取草鱼肝脏补体c3mrna,利用primer5引物设计软件设计引物,采用10μl逆转录反应体系合成cdna,用核酸定量仪测定rna浓度。实验数据使用spss16.0统计软件进行分析,结果以平均值±标准差表示,采用单因素方差分析及lsd对样品进行多重比较。pcr结果显示,0.06%、0.12%、0.24%盐酸小檗碱给药组补体c3mrna表达均上调,与对照组比较,各给药组补体c3mrna表达上调比例分别为20.57%、27.35%、26.49%,具有显著性差异(p0.05),上调的趋势与血清中补体c3的结果类似。研究表明盐酸小檗碱能上调草鱼补体c3mrna的表达。5、补体消耗试验草鱼空白血清中加入盐酸小檗碱配制成2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l,80mg/l的盐酸小檗碱血清溶液,进行补体消耗试验。实验结果表明:盐酸小檗碱在血清中浓度达到5mg/l,可以激活补体c3,但未达显著水平。当盐酸小檗碱浓度达到10mg/l,激活作用达到显著水平(p0.05)。表明高浓度的盐酸小檗碱通过与补体c3的结合改变补体c3的构型从而激活补体c3,激活程度呈剂量依赖关系。6、草鱼体内盐酸小檗碱药代动力学研究取健康草鱼72条(500±10 g),按48mg/kg鱼体重灌服盐酸小檗碱(5mg/m L),分别在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、36h尾静脉采血,各时间点设置6个重复,同时取空白血浆做方法学试验。实验方法学表明,本方法稳定性好,具有可重复性,药代动力学实验结果显示药-时曲线出现2个峰,分别为0.243 mg/L和0.117mg/L。该剂量下的峰浓度Cmax低于盐酸小檗碱激活补体C3所需的浓度(5 mg/L)。实验结果表明灌服该剂量的盐酸小檗碱,体内血药浓度不足以达到激活补体C3所需浓度。
【关键词】：草鱼 黄连 盐酸小檗碱 补体C3 药代动力学
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 第1章 文献综述14-24
• 1.1 黄连概述14
• 1.2 我国鱼病害主要现状14-15
• 1.2.1 生物引起的疾病14
• 1.2.2 非生物引起的疾病14-15
• 1.3 黄连在治疗鱼病作用的研究现状15-18
• 1.3.1 抑菌、杀菌作用15
• 1.3.2 免疫调剂作用15-16
• 1.3.3 驱杀寄生虫、抗病毒作用16-17
• 1.3.4 诱食作用17-18
• 1.4 补体系统在鱼类免疫能中的作用18-24
• 1.4.1 补体系统18-20
• 1.4.2 硬骨鱼补体系统的特点20
• 1.4.3 补体对病原体的作用20-24
• 第2章 引言24-26
• 2.1 立题依据24-25
• 2.2 研究的主要内容25-26
• 第3章 黄连中生物碱的提取分离与鉴定26-34
• 3.1 实验材料和仪器26-27
• 3.1.1 实验材料与试剂26-27
• 3.2 实验方法27
• 3.2.1 黄连总生物碱的制备27
• 3.2.2 高速逆流色谱法（HSCCC）分离27
• 3.3 结果与分析27-32
• 3.3.1 溶液系统的选择27-30
• 3.3.2 HSCCC分离制备的结果30-31
• 3.3.3 结构鉴定31-32
• 3.4 结论32-34
• 第4章 盐酸小檗碱对感染嗜水气单胞菌草鱼存活率的影响34-40
• 4.1 实验材料和仪器34-35
• 4.1.1 主要试剂34
• 4.1.2 主要仪器34
• 4.1.3 实验细菌34-35
• 4.1.4 实验动物35
• 4.2 实验方法35-37
• 4.2.1 细菌溶液制备35
• 4.2.2 细菌浓度的确定（麦氏比浊法）35-36
• 4.2.3 制备实验饲料36
• 4.2.4 实验设计36-37
• 4.2.5 数据处理37
• 4.3 实验结果37
• 4.4 小结与讨论37-40
• 第5章 盐酸小檗碱对草鱼非特异性免疫功能的影响40-48
• 5.1 实验材料和仪器40-41
• 5.1.1 主要试剂40
• 5.1.2 主要仪器40-41
• 5.1.3 实验动物41
• 5.2 实验方法41-43
• 5.2.1 制备实验饲料41
• 5.2.2 实验设计41-43
• 5.2.3 数据处理43
• 5.3 实验结果43-46
• 5.3.1 盐酸小檗碱对草鱼血清中补体C3含量变化的影响43-44
• 5.3.2 盐酸小檗碱对草鱼血清溶菌酶活性影响44-45
• 5.3.3 盐酸小檗碱对NBT活性的影响45-46
• 5.4 小结与讨论46-48
• 5.4.1 盐酸小檗碱对草鱼血清中补体C3的影响46-47
• 5.4.2 盐酸小檗碱对草鱼溶菌酶活性的影响47
• 5.4.3 盐酸小檗碱对草鱼NBT活性的影响47-48
• 第6章 盐酸小檗碱对草鱼补体C3 mRNA表达的影响48-52
• 6.1 实验材料和仪器48-49
• 6.1.1 主要试剂48-49
• 6.1.2 主要仪器49
• 6.1.3 实验动物49
• 6.2 实验方法49-50
• 6.2.1 制备饲料49
• 6.2.2 实验分组49
• 6.2.3 草鱼肝脏补体C3mRNA提取49-50
• 6.2.4 设计引物50
• 6.2.5 反转录及荧光定量PCR50
• 6.2.6 数据处理50
• 6.3 实验结果50-51
• 6.4 小结与讨论51-52
• 第7章 补体消耗试验52-56
• 7.1 实验材料与仪器52-53
• 7.1.1 主要试剂52
• 7.1.2 主要仪器52
• 7.1.3 实验动物52-53
• 7.2 实验方法53
• 7.2.1 补体消耗试验53
• 7.2.2 数据处理53
• 7.3 实验结果53-54
• 7.4 小结与讨论54-56
• 第8章 盐酸小檗碱在草鱼体内药代动力学研究56-64
• 8.1 实验材料和仪器56-57
• 8.1.1 主要试剂56
• 8.1.2 主要仪器56
• 8.1.3 实验动物56
• 8.1.4 色谱条件56-57
• 8.2 实验方法57-58
• 8.2.1 实验溶液的配制57
• 8.2.2 血液样品前处理57
• 8.2.3 方法学验证57-58
• 8.2.3.1 专属性考察57
• 8.2.3.2 标准曲线的制备57-58
• 8.2.3.3 回收率和精密度58
• 8.2.4 实验设计58
• 8.2.5 数据处理58
• 8.3 实验结果58-62
• 8.3.1 专属性考察58-59
• 8.3.2 标准曲线与最低检测限（LLOQ）59-60
• 8.3.3 回收率和精密度60-61
• 8.3.4 口灌盐酸小檗碱药时曲线61-62
• 8.4 小结与讨论62-64
• 第9章 结论与展望64-66
• 参考文献66-72
• 附录72-76
• 致谢76-78
• 硕士研究生期间发表的学术论文78

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本文编号：1080653