普鲁士蓝联合血液灌流治疗急性铊中毒—特异性巯基化合物及神经递质的研究

发布时间：2017-10-29 11:05

  本文关键词：普鲁士蓝联合血液灌流治疗急性铊中毒—特异性巯基化合物及神经递质的研究

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【摘要】：目的采用高效液相色谱法(HPLC)测定急性铊中毒犬经不同方法治疗后血浆中谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及脑组织中兴奋性、抑制性氨基酸含量的变化,进一步探究体内铊与巯基结合,引起脂质过氧化以及神经毒性损害的机制,为急性铊中毒治疗提供理论依据。方法1、动物模型：24只比格犬随机分成4组,雌雄各半(n=6),分别为染毒对照组、普鲁士蓝治疗组(PB)、血液灌流治疗组(HP)以及普鲁士蓝联合血液灌流治疗组(PB+HP),各组均给予硝酸亚铊(TINO3)半数致死剂量(LD50=45mg/kg)灌胃染毒,对照组染毒后不做任何处理；PB组于首次染毒后4小时给予普鲁士蓝灌胃,剂量为467mg/kg/d,分3次,连续5日；HP组染毒后4小时开始进行血液灌流,每次2小时,每日1次,连续5日；PB+HP组染毒后4小时给予PB组联合HP组的处理方式；期间观察动物体重,精神状态,饮食情况变化,10日后处死,分离并留取不同脑区脑组织。2、高效液相色谱法测定血浆中谷胱甘肽及半胱氨酸的含量：4组动物分别进行染毒前及染毒后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192h、216 h、240 h采血1 ml,冰浴,立即离心,取上清,以青霉胺为内标,DTNB为衍生化试剂,衍生化处理后,采用高效液相色谱—紫外(HPLC-UV)法,色谱柱为ZORBAX SB-C 18(4.6×250 nm,5 μm),流动相：A 0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH=5.6)-甲醇(90：10)；B甲醇-水(90：10),甲醇梯度洗脱,流速：1 ml/min,柱温30℃,检测波长：320 nm,检测血浆中谷胱甘肽和半胱氨酸的含量,剩余血浆置于-79℃,以便日后测定。3、高效液相色谱法测定脑组织中兴奋性及抑制性氨基酸的含量：观察10日后麻醉处死动物,分别取脑组织的皮质、纹状体、海马、下丘脑、小脑及脑干各0.1 g,按质量／体积之比1：10加入0.1 mol/L的高氯酸,匀浆机冰浴匀浆后加入冷冻离心机(4℃,16000 r,15min),离心后取上清液500 μl,用1 mol/L的氢氧化钠将组织液调pH=9,定容至1ml,以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂,采用高效液相色谱—荧光(HPLC-FLU)法,色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm,5 μm),流动相为B 0.1 mol/L磷酸二氢钠-0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(用磷酸调至pH=4.5)：甲醇(85：15),A纯乙腈；乙腈梯度洗脱,流速1 ml/mm,柱温26-C,波长：230/450 nm,荧光检测器检测脑组织中兴奋性及抑制性氨基酸含量。结果建立高效液相色谱法测定血浆中谷胱甘肽及半胱氨酸模型,GSH、Cys及青霉胺分别在2.9 min.4.0 min及9.0 min被分离出,峰型良好,分离度高。GSH在0.714～14.286 μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=15.153X+8.043,相关系数为0.9993；稳定性试验RSD7.61%；日内精密度8.422,日内回收率100.38%-103.47%；日间精密度8.518%,日间回收率98.16%-104.11%。Cys在0.714～14.286μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=17.813X+653.89,相关系数为0.9994；稳定性试验RSD8.01%；日内精密度5.965%,日内回收率97.41%-101.48%；日间精密度7.611%,日间回收率99.79%-108.68%。建立高效液相色谱法测定脑组织中Asp、Glu、Gly及GABA模型,Asp、Glu、Gly及GABA分别在3.5 min、5.0 min、5.6 min及18.4min被分离出,峰型良好,分离度高。Asp在25-500μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=373.95X+3654.60,相关系数为0.9998；稳定性试验RSD8.965%；日内精密度7.526%,日内回收率99.68%-105.69%；日间精密度7.806%,日间回收率94.78%-97.33%。Glu在25-500μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=343.83X+1575.80,相关系数为0.9994；稳定性试验RSD6.512%；日内精密度7.308%,日内回收率97.80%-101.50%；日间精密度7.599%,日间回收率95.50%-107.50%。Gly在25～500 μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=989.64X+4972.90,相关系数为0.9995；稳定性试验RSD5.793%；日内精密度5.653%,日内回收率98.57%-107.67%；日间精密度6.632%,日间回收率98.23%-104.64%。GABA在25-500 μ/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=697.23X+4612.40,相关系数为0.9997；稳定性试验RSD7.925%；日内精密度8.018%,日内回收率98.86%-109.46%：日间精密度8.890%,日间回收率92.66%-104.34%。急性铊中毒染毒对照组、PB组、HP组及PB+HP之间,血浆GSH及Cys浓度均存在差异,主体内效应检验P值均0.05,说明不同时间点GSH及Cys浓度依据分组不同存在差异；主体间效应检验P值均0.05,说明各治疗组与对照组之间GSH以及Cys浓度存在统计学差异,其中普鲁士蓝联合血液灌流组下降最为明显。PB组、HP组及PB+HP组与染毒对照组比较,皮层、下丘脑及海马区Asp及Glu含量存在差异,P值均0.05,其余脑区无明显变化。PB组、HP组及PB+HP组与染毒对照组比较,各脑区抑制性氨基酸含量变化不明显。结论本实验建立的HPLC测量血浆GSH及Cys含量方法及HPLC测量脑组织中Asp、Glu、Gly及GABA方法精确灵敏,稳定性高,可用于铊中毒犬血浆中GSH、Cys及脑组织中四种氨基酸的快速检测。犬急性铊中毒后血浆GSH及Cys均出现明显下降,经PB、HP及二者联合治疗后下降程度降低,PB+HP组最为明显。急性铊中毒犬各脑区EAA及IAA含量不等,犬经PB、HP及二者联合治疗后,皮层、下丘脑及海马EAA含量较中毒对照组均有所下降,PB+HP组下降最为明显,IAA无明显变化。综合分析提示GSH、Cys与EAA在急性铊中毒致病机制中发挥一定的作用,PB、HP及PB+HP治疗均有效,PB+HP效果最为明显,可能是救治急性铊中毒最为理想的手段。
【关键词】：铊中毒 HPLC 巯基化合物 兴奋性氨基酸 抑制性氨基酸
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R595
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-20
• 1. 铊中毒现状及损伤机制14-15
• 1.1 竞争性抑制钾离子14
• 1.2 与巯基结合14
• 1.3 与核黄素结合14-15
• 1.4 铊的细胞毒性15
• 1.5 铊导致脂质过氧化15
• 1.6 其他损伤机制15
• 2. 铊中毒治疗进展15-17
• 2.1 一般治疗15
• 2.2 应用解毒剂15-16
• 2.3 血液净化治疗16-17
• 2.4 普鲁士蓝联合血液净化治疗17
• 2.5 对症支持治疗17
• 3. 谷胱甘肽及半胱氨酸与脂质过氧化17-18
• 4. 兴奋性、抑制性氨基酸及其损伤机理18
• 5. 高效液相色谱法测定样品的特点及优势18-19
• 6. 实验指导思想、研究思路和研究方法19-20
• 第一部分：基于高效液相色谱法构建血浆中谷胱甘肽、半胱氨酸含量的监测方法20-25
• 1. 实验材料20-21
• 1.1 实验仪器20
• 1.2 实验试剂20
• 1.3 液体配制20-21
• 2. 实验方法21-22
• 2.1 色谱条件21
• 2.2 血浆样品处理方法21
• 2.3 标准曲线绘制21-22
• 2.4 稳定性试验22
• 2.5 精密度试验22
• 3. 实验结果22-24
• 3.1 标准曲线22-23
• 3.2 稳定性试验23
• 3.3 精密度试验23-24
• 4. 讨论24-25
• 第二部分：基于高效液相色谱法构建脑组织中兴奋性及抑制性氨基酸的监测方法25-29
• 1. 实验材料25-26
• 1.1 实验仪器25
• 1.2 实验试剂25
• 1.3 液体配制25-26
• 2. 实验方法26-27
• 2.1 色谱条件26
• 2.2 标准曲线绘制26
• 2.3 稳定性试验26-27
• 2.4 精密度试验27
• 3. 实验结果27-28
• 3.1 标准曲线27
• 3.2 稳定性试验27-28
• 3.3 精密度试验28
• 4. 讨论28-29
• 第三部分：不同治疗手段对犬急性铊中毒后血浆中巯基化合物及脑组织中氨基酸含量的影响29-40
• 1. 实验材料29-31
• 1.1 实验动物29
• 1.2 实验仪器29
• 1.3 实验试剂29-30
• 1.4 液体配制30-31
• 2. 实验方法31-32
• 2.1 动物分组31
• 2.2 染毒对照组处理方法31
• 2.3 普鲁士蓝治疗组处理方法31-32
• 2.4 血液灌流组处理方法32
• 2.5 普鲁士蓝联合血液灌流组处理方法32
• 2.6 血浆中巯基化合物含量的测定32
• 2.7 脑组织中氨基酸含量的测定32
• 3. 统计方法32
• 4. 结果32-36
• 4.1 各治疗组犬血浆中谷胱甘肽的变化32-33
• 4.2 各治疗组犬血浆中半胱氨酸的变化33-34
• 4.3 各治疗组犬脑组织兴奋性及抑制性氨基酸的含量34-35
• 4.4 各治疗组犬的生存曲线35-36
• 4.5 犬在治疗期间状态的观察36
• 5. 讨论36-40
• 5.1 铊中毒对血浆巯基化合物的影响36-38
• 5.2 铊中毒对脑组织EAA及IAA的影响38-39
• 5.3 不同手段对铊中毒犬治疗效果分析39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-47
• 综述 铊中毒机制研究进展47-53
• 参考文献50-53
• 论著 高效液相色谱法测定铊中毒犬不同脑区兴奋性及抑制性氨基酸含量变化53-61
• 个人简历61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘春雅;刘敏;;血液灌流抢救重症急性中毒的临床观察[J];当代医学(学术版);2008年04期

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本文编号：1112683