磷酸化p38 MAPK在2型糖尿病大鼠胸主动脉中的表达及利拉鲁肽的干预作用

发布时间：2017-11-01 08:19

  本文关键词：磷酸化p38 MAPK在2型糖尿病大鼠胸主动脉中的表达及利拉鲁肽的干预作用

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【摘要】：目的:糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一组以慢性血浆葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病,其中,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占DM的90%以上。随着人民生活水平的提高,我国T2DM的患病率逐年上升,因DM并发症死亡的人数也逐年增多。在诸多并发症中,大血管并发症是T2DM患者的主要死亡原因,约80%的T2DM患者死于大血管疾病。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是T2DM大血管病变的主要病理特征,与单纯的AS相比,T2DM患者的AS发生早、范围大、程度重。研究显示,AS的病理改变与丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)的过度激活有关。p38 MAPK通路属于MAPK家族,与内皮细胞损伤关系密切,是参与炎症反应的细胞内重要信号通路。由此我们推测,磷酸化p38 MAPK参与了T2DM大血管病变的发病过程。利拉鲁肽是一种GLP-1类似物。研究显示,利拉鲁肽不仅具有降糖作用,而且可能具有改善血管内皮功能和抗炎作用。本课题通过高脂、高糖饲料饲养wistar大鼠,建立具有T2DM动脉粥样硬化特点的动物模型,观察T2DM大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK蛋白表达水平的变化以及利拉鲁肽干预治疗对其表达的影响,探讨p38 MAPK与T2DM动脉粥样硬化的关系及利拉鲁肽的干预作用。方法:选用4周龄健康雄性wistar大鼠24只,适应性饲养1周后,按照随机数字表将大鼠随机分为对照组(NC,n=6)和实验组(EXP,n=18),NC组采用标准饲料喂养,EXP组采用高脂高糖饲料喂养(20%的蔗糖、10%的熟猪油、2.5%的胆固醇、1%的胆酸、66.5%的标准饲料)。喂养4周后,EXP组大鼠隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30mg/kg,NC组仅注射等容积的柠檬酸缓冲液。于实验的第6周测大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),选择血糖≥7.8mmol/L者为糖尿病成模标准(18只实验组大鼠中,14只造模成功)。将成模的14只EXP组大鼠随机分为2组:2型糖尿病空白对照组(DM,n=7)、2型糖尿病+利拉鲁肽干预组(LIR,n=7)。LIR组给予利拉鲁肽100ug/kg皮下注射,每日2次,NC组和DM组给予等量的生理盐水皮下注射,共8周。于实验第14周末分别测量各组大鼠体重,行腹腔葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test,IPGTT),采用近似梯形面积的方法计算葡萄糖曲线下面积(Glucose Area under the curve,AUCg,mmol·L-1·h)和胰岛素曲线下面积(Insulin Area under the curve,AUCINS,m IU·L-1·h),并计算稳态模型-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(m IU/L)/22.5和稳态模型-胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)=20×FINS(m IU/L)/[FPG(mmol/L)-3.5]。处死动物前,将实验动物麻醉后心尖取血、分离血清,测定FBG、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol HDL-C)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)水平。取胸主动脉,予以4%多聚甲醛固定,进行HE染色,光镜下观察血管病理变化;免疫组织化学法测胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的蛋白表达水平。以人工计数方法统计大鼠主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1的蛋白表达水平。统计分析采用SPSS13.0软件进行,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1各组大鼠一般情况NC组大鼠一般情况良好,体重逐渐增加。DM组大鼠多食、多饮、多尿症状明显、体重有所增加,LIR组无明显多食、多饮、多尿症状,体重有所增加。各组大鼠体重差异无统计学意义(NC 320.7±12.0g;DM326.3±69.6g;LIR 316.3±34.2g)。2各组大鼠血清生化指标结果2.1实验6周末数据NC组大鼠FBG为6.50±0.52mmol/L,EXP组为15.90±4.85mmol/L,EXP组FBG较NC组明显升高(P0.05)(Table1,Fig.1)。2.2实验14周末(即利拉鲁肽干预8周末),三组大鼠各项指标2.2.1三组大鼠血糖水平DM组FBG 12.99±2.07 mmol/L,LIR组FBG 8.87±1.82 mmol/L,均明显高于NC组FBG 6.33±0.69 mmol/L(P0.05);LIR组FBG较DM组明显下降(P0.05);DM组和LIR组AUCg分别为[(34.34±7.63)mmol·L-1·h]和[(27.67±4.93)mmol·L-1·h],均明显高于NC组[(18.72±3.27)mmol·L-1·h](P0.05),LIR组AUCg较DM组明显下降(P0.05)(Table2,Fig.2,3)2.2.2三组大鼠胰岛素水平、胰岛素抵抗指数DM组[(6.49±1.99)m IU/L]和LIR组[(11.13±1.92)m IU/L]空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)明显低于NC组[(18.02±2.52)m IU/L],差异具有统计学意义(P0.05);LIR组FINS水平较DM组明显升高(P0.05);DM组[(27.40±10.32)m IU·L-1·h]AUCINS明显低于NC组[(49.22±4.44)m IU·L-1·h]和LIR组[(40.42±6.71)m IU·L-1·h](P0.05),但NC组和LIR组间AUCINS无明显差异(P0.05);三组间HOMA-IR无明显差异(P0.05);DM组(14.04±3.87)和LIR组(45.95±20.65)的HOMA-β显著低于NC组(132.44±30.30)(P0.05),LIR组HOMA-β较DM组明显升高(P0.05)(Table2,Fig.4-Fig.6)。2.2.3三组大鼠血清生化指标NC组:TG 0.80±0.26 mmol/L,TC 2.18±0.39 mmol/L,LDL 1.24±0.47mmol/L,HDL-C 1.55±0.33 mmol/L,ICAM-1 75.63±7.97pg/ml,VCAM-1 616.54±54.51 ng/ml,NF-κB 78.68±12.15μmol/LDM组:TG 1.83±0.40 mmol/L,TC 4.15±0.41 mmol/L,LDL 2.53±0.44mmol/L,HDL-C 0.68±0.23 mmol/L,ICAM-1 130.59±16.00pg/ml,VCAM-1 990.19±119.18 ng/ml,NF-κB 170.22±21.53μmol/LLIR组:TG 1.20±0.30 mmol/L,TC 3.42±0.82 mmol/L,LDL 1.86±0.28mmol/L,HDL-C 0.92±0.11 mmol/L,ICAM-1 97.81±7.62pg/ml,VCAM-1 797.58±131.10ng/ml,NF-κB 116.14±32.63μmol/LDM组TG、TC、LDL-C、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB均明显高于LIR组及NC组(P0.05),LIR组上述指标明显高于NC组(P0.05),DM组和LIR组大鼠HDL-C水平较NC组显著降低(P0.05),LIR组大鼠HDL-C水平较DM组有所升高,但差异无统计学意义(P0.05)(Table2,Fig.7-Fig.10)。3胸主动脉病理改变胸主动脉切片HE染色:NC组血管壁结构清晰可见,内膜完整光滑,内膜、中膜、外膜及平滑肌细胞排列整齐,结构清晰。DM组可见主动脉血管壁结构不清晰、管壁厚度不均匀,内膜增厚,内皮细胞肿大变性,内弹力板断裂,中膜平滑肌细胞排列紊乱,胶原纤维增生。LIR组可见主动脉慢性炎症反应较DM组大鼠明显减轻,胸主动脉血管壁无明显隆起,内膜下有少许炎症细胞浸润,但浸润程度下降,平滑肌细胞排列较整齐,血管内皮细胞基本完整,内膜偶有增厚。(Fig.11)4免疫组化结果:细胞浆和细胞膜为MCP-1阳性部位,呈弥漫黄色或棕黄色颗粒。细胞核为磷酸化p38 MAPK、NF-κB阳性部位。NC组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为1(0,4),1.5(0,4),2(0,3)。DM组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为4(1,9),4(1,12),4(1,16)。LIR组大鼠胸主动脉磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达平均积分分别为2(1,6),3(1,4),3(1,6)。和NC组相比,DM组、LIR组大鼠胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达水平明显升高(P0.05),LIR组大鼠胸主动脉中磷酸化p38 MAPK、NF-κB、MCP-1蛋白表达水平较DM组显著降低(P0.05)。Spearman分析显示,胸主动脉磷酸化p38 MAPK蛋白和NF-κB、MCP-1蛋白表达呈显著正相关(r=0.458、0.318,P0.05)。(Fig.12-Fig.14 and table 4)结论:1在大鼠实验中,p38MAPK参与了糖尿病大血管病变的发生。2利拉鲁肽不仅具有降糖作用,还可能通过下调血管p38MAPK磷酸化水平、抑制炎症反应,发挥对糖尿病大血管的保护作用。
【关键词】：大鼠 糖尿病 动脉粥样硬化 p38 MAPK 利拉鲁肽 GLP-1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-13
• 英文缩写13-14
• 前言14
• 材料与方法14-20
• 结果20-23
• 附图23-29
• 附表29-31
• 讨论31-35
• 结论35-36
• 参考文献36-39
• 综述 胰高糖素样多肽-1 及其受体激动剂对2型糖尿病心血管病变的影响39-47
• 参考文献43-47
• 致谢47-48
• 个人简历48

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