白介素-36α在自身免疫性心肌炎小鼠中的促炎作用

发布时间：2017-11-03 08:30

  本文关键词：白介素-36α在自身免疫性心肌炎小鼠中的促炎作用

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【摘要】：研究背景：心肌炎(myocarditis)是一种心肌炎症性疾病,主要表现为心肌细胞坏死和间质炎性细胞浸润,一般诱因有感染、自身免疫、中毒等,常累及心肌细胞、间质及心脏瓣膜、心包,最终导致整个心脏结构受损。因其复杂的发病机制,临床上表现为不同程度的胸闷、气促、气喘、心脏衰竭、猝死等多种症状。在一些没有临床症状的年轻人当中发病率也在逐年升高,他们的总数占40岁以下猝死病例的12%。尽管恢复健康对这些年轻的患者来说还算是比较容易,但是也存在一些遗传易感性的年轻患病者会随着时间的拖延慢慢的进展为慢性心肌炎和扩张型心肌病(DCM),而且有些患者到最后还可能出现急性充血性心脏衰竭的反复发作。虽然心肌炎的概念表面上看上去很简单,但是其诊断和治疗仍然是临床面临的重大难题。病毒性心肌炎(Viral myocarditis, VMC)是一临床常见心血管系统疾病。是由病毒感染引起心肌细胞的变性、坏死、间质炎症细胞浸润及纤维渗出为主要病理改变的疾病。自从1899年Fiedler KL报道了3例病理概念的VMC后,欧美各国关于VMC的报道也越来越多。20世纪70年代,中国及日本等亚洲国家也相继报道了VMC相关病例,近年来随着VMC的发病逐年上升,VMC己成为我国青少年不明原因猝死的主要原因之一。急性VMC患者常无自觉症状或者只是轻微的感冒症状,机体可自行清除病毒而痊愈。10-20%的患者可发展为慢VMC、充血性心衰甚至扩张型心肌病,不仅如此,慢性VMC也常可导致扩张型心脏病的发生,美国调查显示每年新增扩张型心脏病病人多达100,000人,是心脏移植手术量增加的重要原因之一。众所周知VMC严重危害着人们的生命健康,然而迄今为止,由于VMC的发病机制还不完全清楚,对VMC的治疗尚无有效的办法,它涉及病毒的直接损伤、免疫机制、生化机制、心肌纤维化、细胞凋亡等,目前多数研究认为病毒触发的心肌自身免疫反应(即自身免疫性心肌炎(Autoimmune myocarditis, AMC)是VMC进行性心肌损伤的主要原因。如何有效减轻这种免疫反应损伤,成为VMC治疗亟待解决的热点问题。因此,阐明VMC的发病机制具有重要的理论和实践意义。临床上关于病毒性心肌炎的治疗,主要以静脉注射丙种球蛋白调节免疫状态等减轻心肌损害和传统的改善心肌能量代谢等方式,均无明确而有效的治疗方式。近年来国内外很多专家也进行了各种尝试,从不同的角度开展了大量针对治疗该病药物的实验研究,如共刺激分子的基因靶向治疗或抑制炎症因子、调节氧化还原反应药物、调节Th1/Th2炎症因子的分泌药物、抑制心肌重构药物的探索与开发等,试图在治疗方面有所突破。随着对细胞因子研究的不断深入,越来越多的专家将治疗心肌炎的目光聚集在了应用细胞因子治疗上,而且这种方法也获得了一定的研究成果。目前已应用到临床的细胞因子有重组白介素-2,重组干扰素等。IL-36是最近才被命名的IL-1家族新成员,由3个生物学功能相似的分子IL-36α、IL-36β及IL-36 Y组成,IL-36Ra是其天然拮抗剂。IL-36成员的共同受体为IL-36R,可与IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)相结合形成二聚体。细胞外IL-36不跨膜蛋白IL-36R及IL-1RAcP的胞外结构结合后形成复合物,通过胞内区功能域与接头蛋白髓样分化蛋白88 (myeloid differentiation primary response 88, MyD88)结合,活化MAPKs、NF-κB信号级联途径,发挥促炎、活化免疫反应的作用。研究显示,IL-36成员免疫调理及免疫激活作用较传统IL-1家族成员更强,是树突细胞和T细胞的强效调节剂,参与树突细胞与Th细胞的激活、抗原提呈和刺激促炎因子产生,在免疫反应中具有巨大的潜能。主要表现在①对免疫细胞的作用：在体外,小鼠的骨髓来源树突样细胞(BMDC)和CD4+T细胞能对IL-36产生明显的特异性反应,IL-36激活CD4+T细胞中Th1细胞反应；在体内,IL-36能促进树突细胞的成熟,上调树突细胞表面MHC-II和共刺激分子CD80/CD86的表达,增强树突细胞抗原提呈功能,并刺激Th0细胞向Thl细胞分化。Nicklin等研究表明,在促进抗原提呈方面树突细胞对IL-36的反应比对IL-1更强烈。Thl和Th2细胞表达IL-36R mRNA水平较IL-1高。②对细胞因子的作用：鼠骨髓源性树突细胞(BMDCs)和CD4+T细胞持续性表达IL-36R,当受到IL-36刺激,BMDCs产生促炎症性细胞因子如IL-12、IL-18、 IL-6、TNF-γ、IL-23等,CD4+T细胞产生INF-γ、IL-4、IL-17等,这些应答反应均可被IL-36Ra所拮抗。目前IL-36和自身免疫病之间的关系,在心血管系统尚未见报道。心肌a-肌球蛋白重链的肽段诱导的实验性自身免疫性心肌(Experimental autoimmune myocarditis , EAM)动物模型主要用于研究自身免疫机制在心肌炎发病及进展过程中的作用。该模型主要通过人为诱发靶向心肌的自身免疫而致病,因其剔除了其他复杂感染因素的影响,可专门用于自身免疫机制致病的研究,为研究心脏特异性免疫反应和心肌炎症损害提供了极好的实验动物模型。本研究通过皮下注射心肌α-肌球蛋白重链短肽免疫BALB/c小鼠诱导AMC,将实验小鼠在造模第15天,分别予IL-36α和IL-36Ra连续腹腔注射7天,于第21天行小鼠心脏超声检查,酶联免疫吸附法测定血清炎症因子IL-23、IL-17浓度；苏木精-伊红(HE)染色检查心肌病理改变。观察IL-36 α对小鼠AMC模型免疫反应的作用,旨在探讨IL-36 α在AMC发病机制中的作用,为AMC的防治提供新思路。第一章AMC过程中IL-36 a与心肌损伤程度呈正相关目的：选用BALB/c小鼠构建实验性自身免疫性心肌炎(AMC)动物模型,明确AMC时IL-36α表达上调与心肌免疫损伤之间的关系。方法：1.野生型雄性BALB/c小鼠(六周龄),体重14-18g之间,购自南方医科大学实验动物中心(SPF级环境下饲养)。所有实验动物操作流程均获得实验动物保护权威机构的批准,并遵循南方医科大学动物实验指导准则。2.AMC动物模型的构建将24只BALB/c小鼠随机分成4组,其中包括：正常对照组(C组)；低剂量短肽组(L组)；中剂量短肽组(M组)；高剂量短肽组(H组)。其中后3组小鼠共18只于不同时间先后2次用特异的短肽免疫构建实验性自身免疫性心肌炎动物模型,该特异的短肽为小鼠心肌肌球蛋白重链α-(MyHc-a614-629[Ac-S LKLM ATLFSTYAS AD-OH])。计划在实验第0天和第7天时每一只实验小鼠采用背部皮下注射的方式分别注射准备好的含有短肽的乳化剂共2次。接种后观察大鼠的活动、饮食、毛色及体重变化。分别于首次接种免疫剂后的第14天、21天到B超功能检查室给小鼠做心脏超声检察、采用Western blot检测心肌IL-36 α蛋白表达、给实验小鼠心脏组织切取的标本做苏木素-伊红染色及显微镜下观察并计数后完成病理学评分。结果：在自身免疫性心肌炎的实验动物模型中,用小鼠心肌肌球蛋白重链α-衍生的肽和免疫的弗氏完全佐剂乳化的BALB/c小鼠中诱导的心肌炎,IL-36α在普通小鼠心肌有低水平表达,而在AMC小鼠模型中IL-36 α表达明显增多；并且随着IL-36 α表达增多,心肌炎损伤程度也加重。结论：1.应用小鼠心肌肌球蛋白重链α-衍生的肽免疫BALB/c小鼠可成功的建立EAM模型。2.AMC过程中IL-36α与心肌损伤程度呈正相关第二章IL-36 a促进AMC小鼠心功能恶化目的：探讨白介素-36 α在自身免疫性心肌炎(autoimmune myocardioptis, AMC)小鼠中的促炎作用。方法：1.将40只BALB/c小鼠随机分为对照组(Ctrl组)、AMC组、AMC+IL-36 a组和AMC+IL-36Ra组。取200μg肌球蛋白重链短肽免疫小鼠建AMC模型,在小鼠建模第15天,后两组分别接受IL-36 α和IL-36Ra(0.1ug/只/d)连续7天腹腔注射,对照组与AMC组小鼠仅接受等剂量生理盐水腹腔注射。于实验第21天检查小鼠各项指标。2.经胸心脏超声检查：将这些小鼠先麻醉,测量完每只小鼠体重后,经胸做超声心动图检测,分别测量收缩末期和舒张末期左室内径,通过仪器计算自动获取左室内射血分数和左室短轴缩短率。3.苏木精-伊红(HE)染色检查心肌病理改变：安乐死所有实验小鼠,将心脏标本浸泡在福尔马林中24小时,后经石蜡包理、切片,行苏木素和伊红染色。4.酶联免疫吸附法测定血清IL-23、IL-17浓度：酶联免疫吸附试验试剂盒检测各组小鼠血清中的白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)水平。结果：成功建立小鼠AMC模型后,与Ctrl组相比,实验组小鼠出现不同程度的心功能不全,血清IL-23、IL-17水平均明显增高,心肌病理切片可见炎症细胞浸润,其中又以AMC+IL-36 a组小鼠炎症因子上升、炎症细胞浸润增加及心功能不全最明显,而较AMC组,AMC+IL-36Ra组小鼠的各项指标被显著抑制。结论：1.AMC过程前加入外源性重组IL-36 α,免疫应答增强,加重心肌损伤。2.AMC过程中加入IL-36RA阻断IL-36 α,可抑制免疫应答,减轻心肌损伤。全文总结：1.通过皮下注射心肌α-肌球蛋白重链短肽免疫BALB/c小鼠可成功诱导AMC。2.IL-36α的表达上调可加重AMC小鼠心肌炎症损伤程度。3.IL-36 α作为促炎因子在AMC自身免疫应答中发挥重要作用,它通过促进T细胞增殖及细胞因子分泌的作用,直接参与心肌炎病程,抑制IL-36 α的表达可减轻心肌免疫反应,抑制AMC的进展。
【关键词】：白介素-36α 白介素-36Ra 自身免疫性心肌炎 小鼠
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.21
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 第一章 IL-36α在自身免疫性心肌炎过程中的表达及与心肌损伤程度关系研究25-40
• 1. 实验材料与方法26-35
• 2. 实验结果35-38
• 3. 讨论38-39
• 结论39-40
• 第二章 IL-36α促进AMC小鼠心功能恶化40-55
• 1. 材料与方法44-50
• 2. 实验结果50-52
• 3 讨论52-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-64
• 中英文缩略词对照表64-65
• 攻读学位期间成果65-66
• 致谢66-68

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郭晓辰;张军平;朱亚萍;刘虹;;病毒性心肌炎患者临床转归及预后因素的随访研究[J];中华中医药杂志;2014年05期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 郭晓辰;张军平;朱亚萍;刘虹;;病毒性心肌炎患者临床转归及预后因素的随访研究[A];第五届全国中医药博士生优秀论文专辑[C];2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 高梦莎;外源性IL-17对病毒性心肌炎小鼠淋巴细胞及巨噬细胞分泌细胞因子的影响[D];广西医科大学;2013年

2 黄明山;非诺贝特通过调节Th1/Th2细胞因子的平衡改善自身免疫性心肌炎[D];福建医科大学;2013年

3 赖文盈;IL-17A基因敲除对病毒性心肌炎小鼠抗心肌抗体的影响[D];广西医科大学;2014年

4 林联韵;Th17/Treg细胞在病毒性心肌炎中的作用[D];福建医科大学;2013年

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本文编号：1135432