次氯酸修饰白蛋白对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏线粒体功能及肾间质纤维化的影响

发布时间：2017-11-04 13:08

  本文关键词：次氯酸修饰白蛋白对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏线粒体功能及肾间质纤维化的影响

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【摘要】：研究背景肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis. RIF)是各种肾脏疾病最终进展至终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的共同途径和主要病理基础,其主要特征为肾小管周围毛细血管消失,肾间质炎症细胞浸润,肌成纤维细胞激活,细胞外基质(如胶原、纤维粘连蛋白等)在间质中的沉积。肾间质纤维化涉及免疫炎症反应、肾脏固有细胞凋亡、氧化应激反应增强、成纤维细胞增殖及活化、上皮细胞向成纤维细胞转化等过程,其中,氧化应激在肾间质纤维化发生及发展中发挥着重要作用。氧化应激是指体内或细胞内氧化与抗氧化防御之间严重失衡。越来越多的证据表明氧化应激反应参与肾间质纤维化的发生与发展。Sedeek指出,在病理状态下如慢性肾脏病,组织中的过量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)会导致机体氧化应激的发生,氧化应激激活进而诱导炎症及肾纤维化的发生。线粒体是细胞内活性氧产生的最主要部位,也是氧化应激损伤的首要靶细胞器。线粒体氧化损伤诱导的线粒体功能障碍会导致疾病的发生与进展。目前已经证实线粒体氧化应激损伤及线粒体功能障碍与肿瘤、衰老、帕金森病、阿尔茨海默病、缺血缺氧性脑损伤、脂肪性肝病、糖尿病,脓毒性休克、心肌缺血再灌注损伤等多种疾病密切相关。线粒体功能失常导致ATP消耗、ROS过度产生和细胞色素C (Cyto C)和线粒体DNA等促凋亡因子的释放,通过DNA和蛋白的氧化应激(OS)损伤和促凋亡反应,继之出现炎症和纤维化。肾脏是高能量代谢器官,线粒体含量丰富,线粒体功能失常在肾间质纤维化中可能起关键作用,近年受到越来越多的关注。Granata等研究者发现,在2-3期CKD患者人群中,线粒体呼吸链系统存在异常,线粒体功能受损的主要原因是因为慢性肾脏病患者体内存在过度的氧化应激。有研究表明线粒体功能障碍在慢性肾功能衰竭大鼠模型中参与肾脏纤维化的发展,吡非尼酮和过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)均能够减轻肾脏氧化应激水平,抑制线粒体功能障碍并进一步减轻肾脏纤维化。研究证实肾小管上皮细胞凋亡数目与肾间质纤维化的程度呈密切正相关,能够干预肾小管上皮细胞凋亡的药物亦能抑制巨噬细胞浸润和肾小管间质的纤维化。以上证据表明,线粒体氧化应激损伤诱导的线粒体功能障碍以及肾小管上皮细胞调亡与肾纤维化存在密切关系,针对线粒体氧化应激损伤进行靶向抗氧化治疗成为肾纤维化治疗的一个重要靶点。次氯酸修饰白蛋白(Hypochlorite-modified albumin, HOCl-alb)是体内蛋白氧化的标志物,还是一种强的促氧化应激、促炎症反应介质,与动脉粥样硬化损伤、糖尿病肾病、慢性肾脏病等多种疾病进展密切相关。在大鼠慢性肾衰模型中,HOCl-alb可加速慢性肾衰大鼠尿蛋白排泄,降低肌酐清除率,通过氧化还原敏感的炎症通路加速肾小球硬化及间质纤维化。然而,HOCl-alb作为氧化应激诱导因子,它能否诱导线粒体氧化应激损伤,促使肾脏线粒体功能障碍,进一步促使肾小管上皮细胞调亡加速肾间质纤维化,目前尚无报道。SS肽是由4个氨基酸残基组成的小分子多肽,它含有一个特殊序列结构域,使其能够靶向作用于线粒体而不依赖线粒体膜电位,使其在线粒体内浓度达到细胞外的1000-10000倍。SS肽高浓度积聚于线粒体内膜,减少线粒体ROS产生并清除已产生的ROS,发挥高效抗氧化作用,防止Cyto C等凋亡因子释放到细胞浆,对线粒体氧化应激损伤起到保护作用。目前,SS肽已经在缺血性脑损伤、糖尿病视网膜病变、阿尔茨海默病等动物模型中发挥出其高效的抗氧化作用。但其对肾间质纤维化是否具有保护作用及其机制目前尚不十分清楚。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)是一种成熟的研究凋亡和纤维化的实验模型。本研究以大鼠单侧输尿管结扎为肾间质纤维化模型,旨在验证我们提出的假说：HOC1-alb诱导线粒体氧化应激损伤,促使线粒体功能障碍,促进肾小管上皮细胞凋亡,进一步加速肾间质纤维化,SS肽可能减轻HOC1-alb所致的肾脏线粒体氧化损伤,从而起到了保护肾脏的作用。研究方法一、无内毒素HOC1修饰的大鼠血清白蛋白(HOC1-RSA)的制备和鉴定：将纯化的无内毒素大鼠血清白蛋白(RSA)溶液与HOC1 (200mmol/L)按照1：140摩尔比混合,室温避光孵育30分钟。制备的HOC1-RSA装入透析袋,在4℃无菌PBS溶液中透析24小时,每隔4-6小时换一次新配制的无菌PBS溶液,以去除游离的次氯酸。透析结束后,用除菌滤器过滤除菌,应用内毒素去除胶柱去除内毒素。配制过程中所有玻璃器皿均经180℃烘烤4小时去内毒素处理。利用鲎试验法内毒素检测试剂盒检测制备的HOC1-RSA内毒素水平,并证实内毒素水平低于0.025 Eu/m1。体外制备的HOC1-RSA浓度为5.3±0.4 nmol/mg蛋白质,对照样本的HOC1-RSA含量为0.2±0.03 nmol/mg蛋白质。二、SS肽的合成和进入线粒体的鉴定1.SS肽的合成SS肽由杭州中肽公司协助合成,SS肽氨基酸序列和化学结构各个SS肽氨基酸序列如下：SS-02 (Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine), SS-31 (D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)。2.线粒体提取取肾组织(皮质)100mg,按照试剂盒说明书提取线粒体。3.SS肽体外进入线粒体的鉴定用固相法合成SS-02 (Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine),用[3H]标记SS-02,采用液体闪烁计数仪进行在线粒体中定位的实验研究。结果显示,SS-02分布于线粒体外膜约20-30%,线粒体内膜约50%,线粒体基质20-30%。三、动物模型建立和分组1.单侧输尿管梗阻模型(UUO)建立：雄性SD大鼠(购自xx实验动物中心),初始体重180-220 g,在恒温清洁环境(南方医科大学SPF级实验动物中心)适应性饲养1周后,以3%戊巴比妥钠0.15 ml/kg腹腔麻醉,仰卧位固定于手术台上,剪毛后常规碘酒酒精消毒,行腹中线切口(切口长度3-4 cm左右),逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层,盐水纱布把肠包到旁边,暴露左肾,向下探寻左侧髂血管(左输尿管跨过左髂总动脉),寻找到左输尿管并游离,分别在输尿管上1/3处和中1/3处用4-0号丝线结扎,在两结扎点之间切断输尿管防止逆行性感染,逐层缝合关腹。假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断。手术过程注意无菌操作原则。2.动物分组(1)假手术对照组：假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断；(2)UUO大鼠+生理盐水注射组：尾静脉注射同UUO大鼠+RSA注射组及UUO大鼠+HOC1-RSA注射组等体积的生理盐水：1次/日；(3)UUO大鼠+RSA注射组：尾静脉注射未经修饰的正常大鼠白蛋白：RSA100 mg/kg,1次/日；(4)UUO大鼠+HOC1-RSA注射组：尾静脉注射次氯酸修饰的大鼠白蛋白(HOC1-RSA):HOC1-RSA 100 mg/kg,1次/日；(5)UUO大鼠+HOC1-RSA+SS-31干预组：尾静脉注射HOC1-RSA 100 mg/kg,1次/日；同时给予SS-31 3mg/kg腹腔注射1次/日。四、标本留取和指标检测：于分组后第14天麻醉处死动物,留取肾组织标本,进行后续检测。1.线粒体损伤指标检测：(1)电镜观察肾皮质线粒体超微结构；(2)差速离心法提取肾皮质线粒体,采用JC-1染色法结合荧光酶标仪检测线粒体膜电位；(3)差速离心法提取肾皮质线粒体,采用荧光探针DCFDA染料法结合荧光酶标仪测定线粒体内ROS;(4)提取肾皮质总DNA,应用real-time PCR测定线粒体mtDNA的拷贝数；(5)利用“荧光素酶-荧光素体系”检测肾组织三磷酸腺苷(ATP)。2.氧化应激指标检测：(1)肾皮质匀浆的HOC1-alb浓度检测：以不同浓度氯胺T制备标准曲线,测定酸性条件下340 nm处吸光值；(2)采用TBA显色法检测脂质过氧化产物硫代巴比妥酸反应活性物质(TBARS);(3)采用WST-8法检测肾匀浆锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力。3.凋亡指标检测：(1)原位末端标记法(TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡及计数；(2)应用Western blotting检测肾组织cleaved caspase-3/7/9、PARP-1 (89kd)、线粒体及胞浆细胞色素C；4.纤维化指标检测：(1)肾脏病理观察：肾组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片,行Masson染色,显微镜观察肾间质纤维化病变程度并拍照；(2) Western blot、real-time PCR及免疫组化检测Collagen-I、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、 Fibronectin。五、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS 20.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,组间两两比较方差齐采用LSD法,方差不齐采用Dunnett's T3检验,P0.05为差异有统计学意义。结果一、HOC1-alb对线粒体结构及功能的影响1.注射HOC1-RSA对UUO大鼠肾皮质线粒体形态及结构的影响电镜结果显示：与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾皮质线粒体均出现不同程度的形态肿胀,灶性空化,嵴模糊不清甚至消失(P0.05), HOC1-RSA注射进一步加重UUO大鼠肾皮质线粒体病变(P0.05),SS-31治疗可减轻注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾皮质线粒体病变程度加重(P0.05)。2.注射HOC1-RSA加重UUO大鼠肾皮质线粒体功能障碍(1)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠肾皮质膜电位与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾脏线粒体膜电位均显著降低(P0.05),注射HOC1-RSA进一步降低UUO大鼠肾皮质线粒体膜电位(P0.05),SS-31可改善因注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾脏线粒体膜电位下降(P0.05)。(2)注射HOC1-RSA增加UUO大鼠肾皮质线粒体ROS产生与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾小管线粒体产生的ROS均显著升高(P0.05),注射HOC1-RSA进一步增加了UUO大鼠肾小管线粒体ROS产生(P0.05),SS-31可降低注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾皮质线粒体ROS水平增高(P0.05)。(3)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠肾皮质组织ATP产生与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾皮质组织ATP含量均显著降低(P0.05),注射HOC1-RSA进一步降低了UUO大鼠肾皮质ATP含量(P0.05),SS-31可升高注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾皮质ATP含量降低(P0.05)。(4)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠肾皮质mtDNA拷贝数与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾皮质mtDNA拷贝数均显著降低(P0.05),注射HOC1-RSA进一步降低了UUO大鼠肾皮质mtDNA拷贝数(P0.05),SS-31可改善注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾皮质mtDNA拷贝数的降低(P0.05)。二、HOCl-alb对大鼠体内氧化应激的影响1.与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾组织匀浆HOCl-alb水平均显著增高(P0.05),注射HOC1-RSA进一步增加了UUO大鼠肾组织匀浆HOCl-alb水平,SS-31治疗可降低注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾组织匀浆HOCl-alb水平升高(P0.05)。2.与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾组织匀浆TBARS水平均显著增高(P0.05),注射HOC1-RSA进一步增加了UUO大鼠肾组织匀浆TBARS, SS-31治疗可降低注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾组织匀浆TBARS水平的升高(P0.05)。3.与假手术组相比,其他四组UUO大鼠肾组织匀浆Mn-SOD活力均降低(P0.05),注射HOC1-RSA进一步降低了UUO大鼠肾组织匀浆Mn-SOD活力(P0.05),SS-31治疗可改善注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾组织匀浆Mn-SOD活力降低(P0.05)。三、HOCl-alb对肾小管上皮细胞调亡的影响1.与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾小管上皮细胞凋亡明显增多(P0.05),且注射HOC1-RSA可进一步增加UUO大鼠肾小管上皮细胞凋亡数目(P0.05),而SS-31治疗可抑制因注射HOC1-RSA及UUO手术引起的大鼠肾小管上皮细胞的凋亡增多(P0.05)。2.Western结果显示：与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾皮质线粒体内CytoC蛋白水平均显著降低(P0.05),胞浆CytoC蛋白水平均显著增高(P0.05)；注射HOC1-RSA可加剧UUO大鼠肾皮质CytoC由线粒体向胞浆转移(P0.05),SS-31治疗可阻止因注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾皮质CytoC由线粒体向胞浆转移(P0.05)。3.与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾皮质cleaved caspase-3、 cleaved caspase-7、cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表达均增多(P0.05),注射HOC1-RSA进一步促使UUO大鼠肾肾组织cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、 cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表达(P0.05),而SS-31治疗可抑制因注射HOC1-RSA及UUO手术引起的大鼠肾皮质cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、 cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表达增加(P0.05)。四、HOC1-alb对肾间质纤维化的影响1.MASSON结果显示：假手术组未见明显异常,其他四组UUO大鼠肾脏均出现不同程度胶原沉积,HOC1-RSA注射进一步加重UUO大鼠肾间质纤维化程度,SS-31治疗可减轻因注射HOC1-RSA及UUO手术引起的肾间质胶原沉积增多。2.Westemblot与Real-time PCR结果均显示：与假手术相比,其他四组UUO大鼠肾脏Collagen-I 、 Fibronectin、 α-SMA水平均显著增高(P0.05),注射HOC1-RSA进一步增加UUO大鼠Collagen-I 、Fibronectn、 α-SMA表达(P0.05),SS-31治疗可改善注射HOC1-RSA及UUO手术引起纤维化加剧(P0.05)。免疫组化结果显示：假手术组大鼠肾组织Collagen-I Fibronectin、 α-SMA在肾血管平滑肌附近少量表达,而肾间质中表达极少,与假手术组相比,Collagen-I、 Fibronectin、 α-SMA均在其他四组UUO大鼠肾间质不同程度的沉积,其中注射HOC1-RSA进一步增加了Collagen-I、 Fibronectin、α-SMA在UUO大鼠肾间质的表达,SS-31治疗可抑制注射HOC1-RSA及UUO手术引起的大鼠肾组织Collagen-I、Fibronectin、 α-SMA表达的增加。免疫组化结果与real-time PCR及Western-blot结果一致。结论一、UUO大鼠肾组织氧化应激标志物明显增加、线粒体结构和功能受损、肾间质细胞凋亡和肾间质纤维化；二、HOC1-alb是已知的促氧化应激介质,反复注射加重UUO大鼠的上述病理生物学效应；SS-31靶向作用于线粒体减轻了UUO大鼠以及HOC1-alb诱导加重的上述病理生物学效应。提示UUO大鼠肾间质纤维化、肾间质病变进展是由于线粒体氧化应激损伤所致；线粒体氧化应激损伤和功能失常,是肾间质纤维化新的干预靶点；线粒体靶向抗氧化剂SS-31未来可能成为抑制肾间质纤维化和肾脏保护的新药,改善慢性肾脏病预后。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R693.2

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