大鼠骨折愈合过程中神经肽SP、NYP及其受体NK1、NPYR1表达关系的初步研究

发布时间：2017-11-07 20:28

  本文关键词：大鼠骨折愈合过程中神经肽SP、NYP及其受体NK1、NPYR1表达关系的初步研究

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【摘要】：近年来,骨科技术和器械有了长足的发展,很多新的技术与成果面世,但创伤、感染等各种原因造成的骨折、骨不愈合等一直是困扰骨科医生和威胁人类生命健康的医学难题。明确骨的形成、重建、塑形的病理生理学特点及其生物学机制,对于从根本上提高其治疗效果而言是基础和出发点。骨组织为一种带有神经支配、血管伴行的复杂的生物活性组织,能根据需要进行自我修复。骨折修复的过程涉及机体细胞因子、体液、多种组织之间错综复杂的协同作用,与血液供应、神经支配密切相关,充足的血液供应是保证骨组织愈合的先决条件；而完善的神经支配起到协调与反馈作用,保证其修复区域内环境的生物学稳定。血液供应的重建在骨及移植物保持生物学活性的重要作用已被国内外众多研究者探讨并证实,此外,骨组织再生过程中神经因素同样发挥着非常重要的作用。与血管因素相比,神经因素如何影响骨折愈合、骨再生及其在骨代谢中的具体作用机制仍远未明确。有学者进行关于神经因素对于骨折愈合、骨重建调节作用的研究中,已表明人长管状骨中有感觉神经和交感神经纤维存在,这些神经纤维与骨的重塑和生长有关；1960年,Gibson首次报道合并中枢神经系统损伤的股骨骨折的病人,其骨折处有较多的骨痴形成,在骨痴的量以及骨痴的形成速度方面均比单纯股骨骨折患者多和快。此外,国外研究也证实神经因素对骨修复、骨折愈合具有调节作用。这些研究与实践结果证实神经因素在骨代谢中起着重要的生物调节作用。已有研究结果表明骨组织中的神经纤维主要为肽能神经。骨组织营养和代谢状况主要是通过肽能神经分泌的神经肽来介导实现,这些肽能神经大多与血管伴行,有少数游离神经末梢伸出并止于骨膜衬里细胞层、骨髓细胞团等,其作用的靶细胞为成骨细胞和破骨细胞。神经肽是机体各种组织生成的具有神经调节活性的肽类物质,具有广泛的生物学效应,其中,NPY是最具代表性的物质。SP和CGRP是感觉神经纤维分泌的两种主要神经肽；NPY由自主神经分泌。其中CGRP已有大量研究结果,作用及机制已基本明确。而对于SP、NPY的研究相对较少。神经肽SP属于一种可由骨骼感觉神经元分泌的速激肽,由11个氨基酸组成。在骨生理调节中起着重要作用,3种SP受体分别为NK1受体、NK2受体、NK3受体,神经肽SP在许多生理过程中的调节作用是通过NK1受体发挥作用。NPY主要由大脑弓状核合成,其阳性神经纤维广泛分布于骨髓、骺端、骨膜等代谢活跃区,在血管周围也可以观察到NPY阳性纤维的包绕。NPY通过作用于五种Y受体(Y1,Y2,Y4,Y5和Y6)发挥其生物学作用,这五种受体均属于G蛋白偶联受体。其中Y1、Y2受体与成骨细胞的诱导分化、增殖等密切相关,近年也有研究结果表明Y4也参与骨代谢。本课题组前期研究结果表明骨髓基质干细胞(BMSC s)表达CGRP、SP、NPY受体,并且细胞实验证实外源性添加神经肽能通过其相关受体促进BMSC向成骨细胞方向增殖、分化,国外相关研究也表明成骨细胞上表达神经肽受体,以及神经肽参与骨折修复,骨代谢。那么随之可以发现一些问题,在骨折愈合过程神经肽与骨折愈合各阶段的分泌是否有量效关系,在骨折断端集中表达于哪些部位?这些都未见相关文献报道。而研究骨折愈合过程中神经肽的分泌需要有合适的动物骨折模型,大鼠因饲养条件简单,投入成本低,养殖周期短,其基因明确并可通过基因修饰来确定某些基因在骨折愈合过程中的分子机制,并且大量的单克隆抗体可用于大鼠,相比大动物投入的实验成本低,周期短等优势而受到科研工作者的青睐。限制大鼠用于动物骨折模型研究的主要因素是缺乏稳定的固定装置。目前,实验用于大鼠骨折固定的器械有髓内针、髓内加压螺钉、带锁髓内钉、微型钢板系统、外固定架等。其对大鼠骨折的固定方式各有优劣。髓内针虽操作简单,但其固定稳定性差,无抗旋转稳定性与抗轴向稳定性。带锁髓内钉和锁定钢板虽然克服了旋转和轴向不稳定的缺点,但其破坏髓内外血运系统,可能影响骨折愈合机制的研究,微型钢板系统通过骨折表面两断端固定,对局部骨折断端愈合可能会产生影响,以至增加实验偏倚。外固定架是本实验研究较理想的骨折固定器械,通过四根克氏针固定骨折两断端,骨折端完全不受植入物的影响,且固定稳定,抗旋转稳定性与抗轴向稳定性好。因此本研究以大鼠为实验对象,通过制作大鼠股骨骨折模型,自制外固定架固定大鼠股骨两断端,并观察其骨折愈合情况,通过X线、Micro-CT、组织学染色检测相关成骨指标评价大鼠骨折模型的重复性及可靠性,骨折模型标准统一、稳定并且重复可靠后大量制作大鼠股骨骨折模型,骨折愈合过程各时间点取材,用Q-pcr、免疫组化检测神经肽SP、NPY及其受体的基因、蛋白表达,观察其在骨折愈合过程中各时间点表达情况。本实验为神经肽相关动物实验提供一定的实验基础及依据,同时也为临床应用治疗骨折以及骨代谢疾病提供新的思路和理论基础。研究目的1.建立一种可靠的,可重复的大鼠股骨骨折模型2.初步探讨神经肽S P、NPY及其受体NK1、NPYR1与骨折愈合各时间点的关系第一部分大鼠股骨骨折模型的建立实验目的：建立一种简单的,可靠的,可重复的大鼠骨折模型.实验方法：1.外固定架的设计与制作：外固定架参照临床实践中应用的单边外固定架而进行设计。外固定架由钛合金材料的主架、外侧夹针块、四根不锈钢自攻螺纹克氏针组成(由天津新中器械公司制作提供)。外固定架可通过调节中心螺纹杆进行外固定架的延长与短缩。自攻螺纹克氏针直径为1.2mm。2.大鼠股骨动物模型的建立：选择健康成年雄性SD大鼠12只,体重在480～550 g之间,所有动物购自南方医科大学实验动物中心。手术过程：充分麻醉后,肌注抗生素预防感染,术野区剃毛,采用左侧卧位,酒精纱布消毒,铺单,沿右下肢外侧切开皮肤,分离前外侧和后侧肌间隔,充分暴露股骨,在股骨两端分别拧入两颗螺纹克氏针,在克氏针上安装主架固定股骨,用带锯片的微型小电锯于股骨中段缓慢截骨,生理盐水冲洗截骨端,截骨完成后冲洗创面,彻底止血后逐层关闭切口。手术过程均在严格无菌条件下进行。术后再次肌注抗生素,酒精纱布包绕外固定架,将动物放回笼中自由进食喂养。3.术后大体观察：术后观察伤口愈合情况、步态、活动能力、饮食状况、有无针道感染、以及外固定架有无松动。4.术后拍摄大腿侧位X片观察骨折断端的对位及骨痂生长情况,micro-CT扫描和定量评估骨折区域的BV/TV值,组织学染色观察成骨情况。实验结果：1.实验动物一般情况：实验选用12只SD大鼠全部存活,并进入实验结果分析。大体观察：所有动物术后切口全部愈合,无感染,术后外固定架固定良好,无松动及退针等现象。动物健康状态良好,外固定架未对动物产生不良影响。X线显示术后骨折断端对位良好,骨痂逐渐增多。Micro-CT结果：四周BV/TV为(49±4)%,八周BV/TV为(61±6)%(p0.05)。2.组织学观察结果：4周骨折端有部分骨痂相连,Masson染色示可见新骨生成；8周骨折断端已桥接,骨髓腔开始相通,外周骨痂减少,Masson染色示新生骨渐趋向成熟。结论：自制微型外固定架能提供大鼠股骨骨折良好的稳定性,本实验提供了一个简单、可靠、可重复的骨折模型。第二部分初步探讨神经肽SP、NPY及其受体在大鼠骨折愈合过程的表达情况实验目的：初步探讨神经肽SP、NPY及其受体NK1、NPYR1与骨折愈合各时间点的关系实验方法：1.建立实验动物模型：选择健康成年雄性SD大鼠55只,体重在480-550g之间。骨折模型建立过程同第一部分。2.分别于术后2、4、6、8、12周各处死8只大鼠和3只正常大鼠,取右侧股骨中段,行HE、Masson染色,X线、Micro-CT评价骨折愈合情况,同时行免疫组化染色检测骨折断端SP、NPY、NK1及NPYR1的表达分布情况,并提取骨折断端组织总RNA行Real-time PCR检测SP、NPY、NK1及NPYR1的转录情况。实验结果：1.X线：术后2周骨折端模糊,4周骨折端已有连续骨痂通过,但仍可见骨折线,6周骨折基本愈合,8周骨髓腔基本已相通,12周骨折愈合并完成重塑。2.HE染色和Masson染色：2周时切片上可见骨折断端；4周骨折端成软骨痂相连；6周骨折基本愈合,Masson染色示断端新生骨较多；8周骨折端骨髓腔开始相通,外周骨痂减少,Masson染色示新生骨质呈蓝红相间,表明新生骨折正逐渐成熟；12周骨髓腔完全相通,骨折基本愈合。3.免疫组化染色：术后免疫组化染色示SP、NK1、NPY在骨折断端的成骨细胞,成软骨细胞周围,新生血管、新生骨周围及骨膜下均有表达,术后4周、6周阳性表达量多,随时间推移8周和12周阳性表达量逐渐减少。NPYR1免疫组化染色示术后2、4周在骨折断端的成骨细胞,成软骨细胞,及骨膜下均有少量表达,术后6周在成骨细胞周围,骨膜下,新生血管和新生骨周围有大量表达,随着时间推移8周和12周表达量逐渐减少。4. Real-time PCR检测SP、NPY、NK1及NPYR1转录情况：术后2周Real-time PCR检测SP、NPY、NK1呈高转录,4周达到高峰,于6、8、12周表达量逐渐下降,在12周表达最低。NPYR1转录在术后2周及4周稍有升高,在6周达到高峰,于8周、12周转录水平逐渐下降,但都高于术后2周、4周的转录及正常骨组织的基因转录。结论：神经肽S P、NP Y及其各自受体在骨折愈合过程中表达均高于正常骨组织,SP、NK1在骨折炎症反应期及骨痂形成期表达量显著增多,并且两者的表达趋势大致相同,提示SP可能通过NK1神经肽在骨折早中期促进骨折愈合,而在骨折愈合晚期神经肽SP、NK1的mRNA转录和表达高于正常骨组织,提示SP和NK1在骨痂的重塑阶段可能也发挥作用；NPY在骨折愈合早中期表达量升高,提示其可能通过相应受体促进骨折愈合,而NPYR1在早期转录和表达均不明显,提示NPY在骨折愈合早期可能不通过NPYR1受体调节骨的生成；NPYR1在骨折早期呈低表达,而在骨折中晚期表达升高,提示NPYR1可能与骨折愈合中晚期骨痂重塑有关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R683

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