右美托咪定减轻急性肾损伤及去乙酰化酶SIRT3介导其肾保护的机制研究

发布时间：2018-01-14 02:10

本文关键词：右美托咪定减轻急性肾损伤及去乙酰化酶SIRT3介导其肾保护的机制研究　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分:生物学标记物早期预测心血管手术后肾损伤的价值以及右美托咪定对术后早期肾损伤的影响目的:评价多项生物学标记物早期预测心肺转流术(Cardiopulmonary bypass,CPB)下心血管手术后肾损伤的价值,探讨右美托咪定对心脏术后早期肾损伤的影响。方法:第1部分:择期拟行CPB下心血管手术患者200例,年龄22～86岁,体重46～87 kg。常规麻醉。记录术后急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)发生情况。于术前1d和术后Oh、2h、6h、12h、24h、48h、72h检测血清肌酐和尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin,NGAL)、胱抑素 C(CystatinC,Cys C)、金属基质蛋白酶抑制剂 2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白 7(Ihsulin-like growth factor binding protein-7,IGFBP-7)浓度,并计算[TIMP-2]×[IGFBP-7]乘积。记录术前1d、术后Oh、24h、48h、72h序贯器官衰竭估计评分(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)和急性生理与慢性健康评估系统Ⅱ(Acute physiology and chronic health evaluation scoring system,APACHE 11)。受试者工作特征曲线_(Receiver Operating Characteristic,ROC)评价 NGAL、CysC、[TIMP-2]×[IGFBP-7]早期诊断术后AKI的价值。第2部分:择期拟行CPB下心血管手术患者60例,ASA分级Ⅱ或Ⅲ级,NYHA心功能分级Ⅱ或Ⅲ级,年龄23～64-岁,体重48～85 kg,采用随机数字表法分为2组(n=30):对照组和右美托咪定组(DEX组)。DEX组麻醉诱导前10min静脉缓慢泵注右美托咪定0.5 μg/kg,继之以0.2～0.5 μg·kg-1·h-1速率持续泵注至术毕,对照组给予等容量生理盐水。记录术后AKI发生情况。于术前1d和术后Oh、2h、6h、12h、24h、48h、72h检测血清肌酐和尿NGAL、Cys C、TIMP-2、IGFBP-7浓度,并计算[TIMP-2]×[IGFBP-7]乘积。结果:第1部分:按照改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)指南诊断AKI,将200例患者根据术后是否发生AK1分为AKI组和非AK1组。AKI组41例,非AK1组159例。两组患者一般情况比较差异无统计学意义(P0.05)。两组患者CPB时间、主动脉阻断时间、手术时间比较差异有统计学意义(P0.05)。AKI患者41例,发生率为20.5%,其中1级21例(51.2%)、2级14例(34.1%)、3级6例(14.6%)。两组患者术后SOFA和APACHEⅡ评分在术后Oh均显著升高,随后逐渐下降。与非AKI组比较,AKI组术后Oh、24h、48h、72h的SOFA和 APACHEⅡ 评分明显升高(P0.05)。AKI 组尿 NGAL、CysC、[TIMP-2]×[IGFBP-7]于术后早期即升高,并持续至术后72h,非AKI组的各项尿指标于术后较早期升高后逐渐下降,术后24～48h回落至术前水平。与非AKI组比较,AKI组术后各时间点尿中NGAL、CysC 和[TIMP-2]×[IGFBP-7]的水平升高(P0.05)。术后 Oh、2h、6h 和 12h,尿 NGAL 的 ROC 曲线下面积(Area under the curve,AUC)分别为 0.689、0.709、0.713、0.803,尿 CysC 的 AUC 分别为 0.639、0.762、0.774、0.812,尿[TIMP-2]×[IGFBP-7]的AUC 分别为 0.687、0.721、0.740、0.779。以尿 NGAL、Cys C、[TIMP-2]×[IGFBP-7]平行试验检验变量时,术后-Oh、2h、6h诊断AKI的AUC分别为0.694、0.773、0.794。以系列试验为诊断变量,术后Oh、2h、6h诊断AKI的AUC分别为0.610、0.631、0.667。三项指标单项检测或联合检测的诊断价值均有统计学意义(P0.05)。AKI诊断敏感性比较,平行试验单项检测系、列试验。第2部分:两组患者一般情况比较差异无统计学意义(P0.05)。按照KDIGO指南诊断AKI,对照组发生AKI患者6例(20.0%),DEX组3例(10%),两组比较差异无统计学意义(P0.05)。两组患者术前Scr以及尿NGAL、Cys C和[TIMP-2]×[IGFBP-7]比较,差异无统计学意义(P0.05)。与术前比较,两组Scr在术后未见升高(P0.05);两组尿NGAL、CysC、[TIMP-2]×[IGFBP-7]在术后0～6h即开始升高,术后12～24h逐渐下降,至术后48～72h回落至术前水平。与对照组比较,DEX组术后2～24h 尿 NGAL 和 CysC 水平降低,术后 0～24h 尿[TIMP-2]×[IGFBP-7]降低(P0.05)。结论:尿NGAL、CysC以及[TIMP-2]×[IGFBP-7]是预测CPB下心血管手术后AKI的早期敏感性指标,三者联合可提高诊断效能。右美托咪定可降低尿NGAL、CysC水平以及TIMP-2和IGFBP-7乘积,减轻心脏术后早期肾损伤。第二部分:超声造影监测下右美托咪定改善肾缺血再灌注引起的微循环灌注障碍的研究目的:应用超声增强造影(Contrast-enhancedultrasound,CEUS)技术定量分析兔肾缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤时微循环灌注的改变,评价右美托咪定对微循环的影响。方法新西兰家兔24只随机分成3组(每组8只):对照组、肾缺血再灌注损伤组(I/R组)和右美托咪定组(DEX组)。I/R组和DEX组切除右肾建立左肾缺血再灌注损伤模型。DEX组在肾缺血前30 min腹腔注射10ug/kg右美托咪定。再灌注24 h后,二维超声测定肾脏大小,彩色多普勒超声血流显像(Color Doppler flow imaging,CDFI)测定肾血流阻力(Resistance index,RI)。超声造影观察肾皮质灌注,时间-强度曲线(Time-intensity curve,TIC)分析达峰时间(Time to peak,TTP)、峰值强度(Peak signal intensity,PSI)、曲线上升斜率(Gradientbetweenstart frame to peak frame,Grad)和曲线下面积(Area under the curve,AUC)。超声造影结束后,留取血标本测定肾功能指标(血肌酐、尿素以及NGAL、CysC),留取尿样本测定尿NGAL、CysC。取肾脏观察病理改变,测定肾皮质中细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)含量。直线相关性分析TIC曲线参数与ICAM-1、VCAM-1表达含量之间的关系。结果:与对照组比较,I/R组和DEX组肾大小和病理改变明显,RI增高,TTP延长,PSI和Grad降低,AUC增加,血肌酐、尿素增加,血清和尿中NGAL、Cys C 水平增加,肾皮质中ICAM-1、VCAM-1含量增加(P0.05);与I/R组比较,DEX组肾大小和病理改变轻微,RI降低,TTP缩短,PSI和Grad增高,AUC减少,血肌酐、尿素水平降低,血清和尿中NGAL、CysC水平降低,肾皮质中ICAM-1、VCAM-1含量降低(P0.05)。TIC参数(TTP、PSI、Grad)与 ICAM-1、VCAM-1 呈相关关系。结论:超声造影结合时间-强度曲线参数能定量分析肾I/R损伤时微循环灌注的改变,右美托咪定可改善肾I/R引起的微循环损伤。第三部分:右美托咪定通过去乙酰化酶SIRT3减轻肾缺血再灌注损伤的机制研究目的:探讨右美托咪定通过去乙酰化酶沉默信息调节因子2相关酶(Sirtuins,SIRT)3保护肾缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤的机制。方法:人近端肾小管上皮细胞系HK2细胞随机分成对照(Control)组、缺氧复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)组、右美托咪定(DEX)组(分为 3 个亚组:0.O01nM、O.O1nM 和 O.1nM 组)。H/R组细胞缺氧(5%C02、1%02、94%N2)24h、复氧(5%CO2、21%02、74%N2)3h建立H/R损伤细胞模型,DEX组在缺氧前60min给予不同浓度的右美托咪定,Control组细胞不做任何处理。HK-2细胞分别以SIRT3小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)和质粒处理建立SIRT3基因敲减和高表达的细胞模型。健康雄性成年C57BL/6J小鼠随机分为3组:假手术(Sham组)、缺血/再灌注(I/R)组、右美托咪定(DEX)组。I/R组小鼠夹闭双侧肾蒂45min、再灌注24h建立肾I/R损伤模型;DEX组在缺血前30min给予右美托咪定(25μg/kg,i.p.),Sham仅打开腹腔。缺血前3d以SIRT3siRNA.转染小鼠建立SIRT3基因敲减动物模型。收集HK-2细胞,流式细胞仪检测细胞死亡和线粒体膜电位。检测小鼠血清Scr、血尿素、血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)和胱抑素 C(CystatinC,Cys C)水平,检测肾组织病理形态学和细胞凋亡,测定线粒体SIRT3活性。测定细胞和组织中亲环蛋白 D(CyclophilinD,CypD)、SIRT3 和细胞色素 C(Cytochrome C,CytC)以及CypD乙酰化水平。结果:与Control组比较,H/R诱导的HK2细胞死亡率增加,线粒体膜电位下降,SIRT3表达下降,CypD乙酰化水平和CytC表达增加(P0.05)。O.01nM、O.1nM浓度的右美托咪定可逆转H/R引起的变化(P0.05),0.1nM右美托咪定效果优于O.O1nM(P0.05)。SIRT3质粒增强右美托咪定的细胞保护作用。SIRT3 siRNA逆转右美托咪定的细胞保护作用。I/R可导致小鼠血清Scr、血尿素、NGAL、CysC水平升高,肾小管损伤评分和细胞凋亡计数增加,SIRT3表达和活性降低,CypD乙酰化水平和CytC表达增加(P0.05)。右美托咪定可逆转I/R诱导的变化(P0.05)。右美托咪定对SIRT3 siRNA小鼠无保护作用。结论:右美托咪定通过上调去乙酰化酶SIRT3,减轻线粒体损害,抑制细胞凋亡,从而改善肾缺血再灌注损伤。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R614

【参考文献】