慢病毒介导siRNA干扰ERK2抑制关节粘连的研究

发布时间：2018-01-14 03:31

本文关键词：慢病毒介导siRNA干扰ERK2抑制关节粘连的研究　出处：《天津医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的本课题通过建立兔膝关节滑膜切除术模型,急性期内局部注射携带小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的慢病毒,然后通过siRNA干扰ERK2,进而阻断SMAD和MAPK通路来抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达,从而抑制关节粘连形成。然后观察其后期效果,并探讨其作用机制。方法选择健康成年日本大耳白兔30只,随机分为对照组(A组)、Ms siRNA组(B组)、ERK2siRNA组(C组),每组10只。所有动物在无菌相同的条件下均行右侧膝关节滑膜切除术,并搔剐髌上囊区域,完成兔膝关节滑膜切除术模型。手术完毕,将兔右膝关节用管型石膏固定于屈曲140°位,时间为4周,对左侧膝关节不行任何处理。在切口闭合后的第3天及第7天,A组局部注射0.1ml无病毒载体培养液、B组局部注射0.1ml慢病毒介导的MS siRNA的培养液、C组局部注射0.1ml慢病毒介导的ERK2siRNA的培养液。每组兔子测量膝关节挛缩角度,方法是采用在固定伸膝力作用下,测量膝关节挛缩角度。动物麻醉完毕,除去管型石膏,平卧位固定右大腿,将右小腿膝下10cm处用绷带套住,另一端系弹簧秤,施加均匀的水平牵引力(5N),被动伸直膝关节。拍摄右膝关节的X线片,股骨与胫骨长轴的夹角,定义为挛缩角。然后动物行右膝关节的大体观察,一盲法观察者观测,半定量计分,并作半定量评估。记分标准：无粘连为0分,薄膜样弱粘连为1分,轻度粘连为2分,中度粘连为3分,严重的纤维性粘连为4分。大体观察之后,将测完角度的兔子处死,在髌上囊处取粘连组织,标本烘干,贮存于-20℃冰箱中。胶原中含有12.5%的羟脯氨酸(质量),故可通过测量粘连组织中轻脯氨酸的含量来折算总胶原含量。先测出标准羟脯氨酸浓度的紫外线吸光度,绘制标准曲线紫外线分光光度仪在560μm处测溶液吸光率,再测定样品羟脯氨酸吸光度,得出羟脯氨酸的含量。进而得出总胶原含量。接着取带着粘连组织的右膝关节,在10%福尔马林—10%硝酸混合液中固定脱钙1周(大头针可轻松刺入骨组织),冲洗后取髌上囊周围的粘连组织,经常规处理制成切片。术后28天荧光显微镜下观察局部病毒携带siRNA对细胞的转染情况,并通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)和免疫组织化学染色观察损伤局部组织瘢痕粘连状况。所有数据经过SPSS11.0统计软件包处理,结果用X±S表示。由单因素方差分析组间t检验进行比较,以P0.05表示差异有统计学意义。结果对照组(A组)、Ms siRNA组(B组)各有一只兔子死亡。1只ERK2siRNA组(C组)兔子因石膏管形出现压迫性溃疡不能使用,除去这3只兔子,留有27只动物作为研究对象。荧光显微镜下观察到4w后在关节腔周围组织中有大量增强型绿色荧光蛋白得以表达,表达部位主要集中在关节囊周围中,并且距损伤边缘越远,绿色荧光密度越低。转染后第28天检测到的荧光强度表明,荧光素酶基因表达,局部注射的慢病毒介导siRNA成功导入靶细胞。Ms siRNA组(B组)关节屈曲挛缩的角度(71°-91°,平均82°),与对照组(A组)差异不明显,无统计学意义(P0.05)。ERK2siRNA组(C组)关节屈曲挛缩的角度(250°-38°,平均32°)明显低于Ms siRNA组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。大体观察时发现Ms siRNA组(B组)粘连成较厚的纤维粘连组织,而ERK2siRNA组粘连教薄弱,对照组盲法半定量评分结果是3.14±0.556分,与对照组(A组)差异不明显,无统计学意义(P0.05)。而ERK2siRNA组(C组)是2.16±0.408分,明显低于Ms siRNA组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。生物化学分析测得羟脯氨酸的质量,然后利用公式羟脯氨酸的质量×8得到胶原的质量,这样lmg干燥粘连组织中的总胶原含量是：Ms siRNA组(B组)134.03±11.68μg,与对照组(A组)差异不明显,无统计学意义(P0.05)。ERK2siRNA组(C组)80.06±10.13μg,明显低于Ms siRNA组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化及HE染色观察到对照组和Ms siRNA组粘连组织致密、粗糙,纤维瘢痕密布,两者在纤维细胞密度方面相差不大；与之相比,ERK2siRNA组粘连组织稀疏、松散,且纤维细胞密度明显比Ms siRNA组和对照组低。结论局部导入慢病毒介导的以ERK2为靶向的siRNA能够安全有效地改善兔模型中关节粘连的形成；这项研究可能为预防关节粘连的形成提供了一种新的途径,涉及较大的动物及临床应用尚需进一步的研究。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of SMAD and MAPK pathway on the proliferation and collagen expression of fibroblasts by establishing a model of rabbit knee synovectomy , which can inhibit the proliferation of fibroblasts and the expression of collagen by interfering with ERK2 by siRNA , thus inhibiting the formation of joint adhesion . Methods 30 rabbits were randomly divided into control group ( group A ) , Ms siRNA group ( group B ) and ERK2siRNA group ( group C ) . All the data were treated with SPSS 11.0 statistical software package , and the result was expressed by X 卤 S . Results Compared with control group ( group A ) , there was no significant difference between ERK2siRNA group ( group C ) and control group ( P0.05 ) . Conclusion Local introduction of lentivirus - mediated siRNA targeting ERK2 can effectively improve the formation of joint adhesions in rabbit model . This study may provide a new way to prevent the formation of joint adhesions , which involves larger animal and clinical application .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R684

【参考文献】