CXCR4基因转染骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退变的实验研究

发布时间：2018-01-14 16:30

本文关键词：CXCR4基因转染骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退变的实验研究　出处：《东南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分：兔骨髓间充质干细胞的培养及鉴定目的：体外分离、培养和扩增的新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs).对培养细胞进行鉴定,为后续实验提供细胞来源。方法：麻醉后无菌获取2周龄新西兰大白兔股骨及胫骨,剪开髓腔,获取骨髓液,用贴壁培养法培养,通过传代纯化筛选得到MSCs,应用MTT法绘制细胞生长曲线,从细胞形态、流式细胞仪分析表面标记物以及成骨、成脂、成软骨分化等方面鉴定MSCS。结果：贴壁培养获取的兔骨髓间充质干细胞经过三代的培养逐渐得到纯化,成熟的干细胞在显微镜下表现为短梭形,轮廓清楚,胞核明显,呈圆形,核质比大。细胞融合后传代培养生长迅速,生长力旺盛,数日即能再次融合,流式细胞仪结果显示MSCs细胞均一性好,97%以上细胞表达干细胞表型CD29、CD90,不表达造血细胞表型CD45及CD34。经过诱导分化培养后MSCs向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,具有干细胞多能横向分化潜能。结论：利用贴壁法培养获得的兔MSCs,经过传代纯化后可以得到纯度较高的MSCs,所得细胞具有干细胞特性,能多向分化,可作为再生医学的种子细胞。第二部分：CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞目的：探讨运用慢病毒介导CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞的方法及其提高细胞体外迁移能力的可行性。方法：用慢病毒表达载体Rabbit CXCR4-pIRES2-EGFP(前期构建)和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度,慢病毒感染MSCs。转染后用台盼蓝染色观察其细胞活力。通过QPCR的方法从mRNA水平检测CXCR4基因在MSCs中表达,用Western blot法检测CXCR4蛋白的含量。通过Transwell趋化实验来检测经过CXCR4转染后的MSCs向SDF-1趋化能力的变化。结果：CXCR4基因转染后的兔MSCs能成功表达CXCR4,转染后干细胞的CXCR4的基因水平和蛋白水平均显著升高。台盼蓝染色显示转染前后细胞活力无明显改变。Transwell趋化实验表明转染CXCR4基因后的MSCs对SDF-1的趋化能力,比未转染的MSCs明显升高(P0.05)。加入CXCR4阻断型抗体AMD3100可有效抑制基因修饰细胞向SDF-1的迁移。结论：通过慢病毒载体能成功将CXCR4基因转染至兔MSCs,转染后对干细胞活力无明显影响,转染后干细胞高表达CXCR4,并能明显提高MSCs向SDF-1趋化的能力。第三部分高表达CXCR4的间充质干细胞对正常椎间盘退变的影响目的：初步探讨高表达CXCR4的骨髓间充质干细胞对正常椎间盘退变的延缓作用,为CXCR4-MSCs治疗椎间盘退变提供方法及理论基础。方法：通过慢病毒载体介导CXCR4基因转染兔骨髓间充质干细胞,使后者高表达CXCR4。取15只新西兰大白兔,全身麻醉后经腹膜后入路暴露椎间盘,用21G针头对L3/4、L4/5、L5/6椎间盘穿刺抽吸髓核后,随即向椎间盘注入20μl PBS或106个/mlCXCR4-MSCs或106个/ml MSCs,从而将实验分为：PBS组(对照组)、CXCR4-MSCs组和MSCs组。术后4周、8周从椎间盘高度指数、组织学、C012及Aggrecan mRNA含量改变等方面观察椎间盘改变,评估干细胞治疗椎间盘退变的疗效。结果：基因转染后荧光观察及Western Blot证实干细胞高表达CXCR4。移植术后4周,三组的椎间盘高度指数均较移植前明显下降,但三组之间差异无统计学意义；术后8周,CXCR4-MSCs组椎间盘高度指数降低较少,与PBS组相比差异均有统计学意义(P0.05)。移植后4周及8周,组织学可见CXCR4-MSCs组和MSCs组移植后椎间盘退变相对PBS组显著减慢,表现出一定的延缓退变作用。RT-PCR结果表明,术后8周,CXCR4-MSCs组和MSCs组Aggrecan mRNA相对表达量较PBS组多,差异具有统计学意义(P0.05)；术后8周三组间Col2 mRNA表达无显著性差别。结论：CXCR4基因转染MSCs能移植椎间盘明显提高髓核Aggrecan mRNA表达,提高椎间盘高度指数,延缓椎间盘退变。第四部分：兔椎间盘退变模型的制作与评价目的：建立一种简单、有效、可重复的新西兰大白兔椎间盘退变模型。方法：取健康成年新西兰大白兔18只,体重在4.4±0.27kg,雌雄不限,排除脊柱畸形。1%戊巴比妥钠麻醉后经腹膜后入路暴露L3/4、L4/5、L5/6三个椎间盘,采用21号针头从椎间盘侧前方刺入,采用自制的限制器将穿刺深度控制在5mm,穿刺针在椎间盘内停留5秒,负压抽出髓核组织,反复穿刺三次。以L2/3,L6/7为对照。术后2、4、8周随机选取6只兔子行腰椎X线摄片测量椎间盘高度指数及MRI扫描观察椎间盘T2信号强度,然后过量麻醉处死,行HE染色,观察椎间盘退变情况并对切片进行组织学评分。结果：穿刺术后所有动物均存活,一例动物出现局部感染,对症处理后好转：X线可见术后2周,椎间盘高度开始下降,4周加重,术后8周出现椎间隙狭窄；MRI观察发现,术后2周开始出现退变,此后纤维环穿刺组术后椎间盘信号强度呈持续减弱趋势,椎间盘高度也不断下降,8周表现为黑色椎间盘,严重退变。HE染色结果表明：椎间盘穿刺造模后,髓核体积减小和细胞减少,纤维环排列紊乱,髓核皱缩并与纤维环逐渐分离。对椎间盘切片的组织学评分结果进行统计分析,发现纤维环穿刺后的椎间盘在术后2、4、8周与对照组相比,评分明显升高,差异均有显著性意义(p0.01),说明穿刺成功地诱导椎间盘退变。结论：纤维环穿刺法可以诱导兔椎间盘缓慢退变,可为后续研究提供可靠的动物模型。第五部分CXCR4基因转染干细胞治疗椎间盘退变目的：评估高表达CXCR4的间充质干细胞能否增强干细胞再生椎间盘的能力,CXCR4基因转染干细胞后能否促进干细胞在椎间盘内的迁移。方法：体外分离培养骨髓间充质干细胞,慢病毒介导CXCR4基因转染MSCs,使其高表达CXCR4,然后SPIO标记,移植到退变的椎间盘内,以MSCs和等体积PBS为对照。术后8周、16周通过X线检测椎间盘高度指数变化,MR示踪干细胞在椎间盘内分布,切片普鲁士蓝染色对照, RT-PCR检测椎间盘内二型胶原mRNA及aggrecan mRNA表达情况。结果：在移植即刻MR,可见SPIO标记的MSCs组移植后在椎间盘内形成了一个低信号区域,而PBS组无明显低信号区域。8周及16周,CXCR4-MSCs组低信号区域逐渐分散,这些环形低信号区域的半径较移植时逐渐分散、变小。停留在体内的干细胞也被普鲁士蓝染色所证实。术后16周,相对于MSCs组,CXCR4-MSCs组可见更多的蓝色颗粒细胞存在于椎间盘内。在基因表达方面,移植后8周,MSCs组髓核内aggrecan及COL2 mRNA表达量较PBS组明显增多,差异具有统计学意义；而CXCR4-MSC组髓核内aggrecan及COL2 mRNA表达量较PBS组也明显增多,差异具有统计学意义(P0.05)。结论：基因转染的MSCs能高表达CXCR4, CXCR4-MSCs提高干细胞再生椎间盘的能力,促进其在椎间盘内停留及迁移。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.53

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