IL-10-hAMSCs的构建及其对小鼠创面愈合中TGF-β1、MMP-1及TIMP-1影响研究

发布时间：2018-01-19 13:40

本文关键词： 人羊膜间充质干细胞白细胞介素-10 创面愈合转化生长因子-1 基质金属蛋白酶1 基质金属蛋白酶组织抑制剂1　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:探讨IL-10基因修饰的人羊膜间充质干细胞(IL-10-h AMSCs)在创面愈合过程中的促创面愈合作用及其与瘢痕形成相关因子TGF-β1、MMP-1及TIMP-1表达变化的关系,为今后IL-10-h AMSCs促进创面愈合、减轻创面纤维化的临床转化应用提供实验依据。方法:1、采用机械分离联合胰酶-胶原酶二步消化法从人羊膜分离提取h AMSCs,用含10%FBS的DMEM-F12培养基,置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养,并传至3代备用。2、将克隆的小鼠IL-10基因链接到LV5载体中,质粒转化、扩增后抽提质粒并进行双酶切鉴定,在293T细胞中包装LV5-IL-10慢病毒载体,再转染h AMSCs,获得IL-10-h AMSCs,荧光显微镜下通过绿色荧光蛋白报告基因表达情况观察、评估病毒转染情况及转染效率。3、取第3代生长活跃的h AMSCs、IL-10-h AMSCs和空质粒转染的h AMSCs,用ELISA试剂盒对上述各组细胞培养上清液进行TGF-β1分泌量的检测分析。4、取7周龄C57BL/6野生型雄性小鼠100只,随机分为空白组、模型组、h AMSCs组、空质粒转染h AMSCs组、IL-10转染h AMSCs组,每组20只。腹腔麻醉后,在小鼠背部中线两侧分别制作1cm×1cm的全层皮肤缺损创面模型,根据分组不同,在创面建立即刻于每个创面周围皮下多点(创缘各边中点距创面1mm处)注射100μL PBS悬浮的不同组别的h AMSCs(细胞总数为1×106个),模型组小鼠则注射等量的PBS,空白组为不进行造模及干预的正常小鼠。另取3只模型小鼠,分别注射IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs和CM-Dil标记的h AMSCs,用于荧光示踪移植细胞的定植存活情况。5、细胞移植后1天、3天、7天、14天分别观察各组小鼠创面的红、肿、渗出及创面愈合情况,计算创面愈合率。再对各时间点切取的创面及创缘组织,分别进行石蜡切片HE染色观察创面及创缘炎性细胞的浸润情况;Masson染色观察创面及创缘胶原沉积情况,计算胶原容积分数;免疫组化观察TGF-β1、MMP-1、TIMP-1表达情况;ELISA观察创面创缘组织中TGF-β1、MMP-1、TIMP-1含量;q PCR检测创面创缘组织TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的表达情况。结果:1、h AMSCs贴壁细胞形态为长梭形、多边形,细胞间相互交联,呈巢状或漩涡状排列。传代后,细胞贴壁生长速度加快,24 h后即可完全贴壁,细胞呈梭形,相互交联紧密,成巢状生长。2、IL-10基因重组质粒双酶切鉴定结果显示目的基因克隆存在,慢病毒滴度测定结果为1×108TU/ml,IL-10慢病毒及空质粒感染h AMSCs72 h后于倒置显微镜下观察可见视野中多数细胞均表达绿色荧光,表明感染率高。3、细胞上清液ELISA结果显示:培养基组TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分别为0.47±0.34ng/L,0.33±0.22ng/L,0.27±0.21ng/L,0.25±0.15ng/L。h AMSCs组TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分别为3.26±0.26ng/L,6.37±0.34ng/L,9.86±0.43ng/L,9.08±0.50ng/L。IL-10-h AMSCs组TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分别为6.35±0.48ng/L,10.2±0.54ng/L,14.96±0.67ng/L,13.92±0.41ng/L。空质粒组TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分别为3.23±0.30ng/L,6.30±0.31ng/L,9.30±0.22ng/L,9.13±0.43ng/L。h AMSCs组及空质粒组与IL-10-h AMSCs组的差异具有统计学意义(P0.05)。h AMSCs组及空质粒组之间无差异(P0.05)。提示体外培养过程中h AMSCs能分泌TGF-β1,IL-10可以促进h AMSCs分泌TGF-β1。4、小鼠背部全层皮肤缺损模型建立后1d、3d观察IL-10-h AMSCs组红、肿、渗出弱于模型对照组、h AMSCs组、空质粒组。7d观察h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组的创面愈合速度快于模型对照组,红、肿及渗出明显减弱,且IL-10-h AMSCs组的愈合速度、红、肿、渗出减弱强度均优于h AMSCs组、和空质粒-h AMSCs组。14d除模型对照组外,创面均100%愈合,且瘢痕增生程度小于模型对照组,IL-10-h ASMCs组最优。结果提示h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组-h AMSCs创面创面愈合优于模型对照组,IL-10-h AMSCs组优于h AMSCs、空质粒-h AMSCs组,以上差异具有统计学意义(P0.05)。h AMSCs利用CM-Dil染色,IL-10-h AMSCs及空质粒-h AMSCs本身表达GFP,建模移植注射后14天取组织块切取冰冻切片,荧光显微镜下观察可见散在荧光分布,表明h AMSCs、IL-10-h AMSCs及空质粒-h AMSCs在组织内定植并存活。5、HE结果提示:在显微镜下观察正常小鼠皮肤组织HE染色,可见表皮完整,伴有毛囊,1d时观察模型对照组、h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组的小鼠创面及创缘均可见大量炎性细胞浸润,创面上方部分组织坏死结痂,IL-10-h AMSCs组炎性浸润相比其他组稍少,3d时h AMSCs移植组、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组炎性细胞浸润量明显少于模型对照组,h AMSCs组、空质粒组、IL-10-h AMSCs组胶原形态较一致,间隙适中,模型对照组胶原大小不一,排列疏松且紊乱。7d时模型对照组仍有炎性细胞浸润,且成纤维细胞数量大,胶原多且密集,h AMSCs移植组、IL-10-h AMSCs组、空质粒组-h AMSCs炎性细胞浸润较前降低,且均少于模型对照组,IL-10-h AMSCs组炎性浸润程度最弱,成纤维细胞量最少,胶原排列有序;h AMSCs组、空质粒组、IL-10-h AMSCs组胶原大小一致,模型对照组胶原数量多排列紊乱。14d时模型对照组有少量炎性浸润,h AMSCs移植组、IL-10-h AMSCs组、空质粒组创面炎性细胞未见明显炎性细胞,胶原形态一致,模型对照组成纤维细胞明显多余其他三组。在显微镜下观察空白组正常小鼠皮肤组织Masson染色切片胶原纤维染呈蓝色,排列有序,间隙适中。1d,各组均见大量坏死组织和炎性细胞浸润。3d,模型对照组胶原数量少且间隙较宽,排列紊乱,大小不一,且大量炎性细胞浸润,h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组相比模型对照组,数量多,呈丝条状,排列相对有序。IL-10-h AMSCs组形态一致,交联密切,容积分数优于其他三组,差异具有统计学意义(P0.05)。7d,h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组较模型对照组胶原排列呈网状结构,胶原间隙适中,数量稍有减少。模型对照组胶原纤维呈旋涡状排列,紊乱无序,胶原粗大且数量多,胶原间隙致密,IL-10-h AMSCs组与其他三组相比容积分数差异具有统计学意义(P0.05)。14d,各组胶原均稳定形成,相对于其它各组,模型对照组排列紧密,成纤维数量多,而IL-10-h AMSCs组成纤维细胞相对较少,胶原排列近似网状结构、间隙适中,差异具有统计学意义。(P0.05)免疫组化结果显示:空白组正常小鼠皮肤可见少量TGF-β1、MMP-1、TIMP-1阳性表达,阳性结果均为胞浆棕黄色。TGF-β1结果:建模后1d、3d,模型对照组可见TGF-β1阳性率逐渐增高,3d时,IL-10-h AMSCs组增高最明显(P0.05);建模后7d、14d,与模型对照组比较,h AMSCs、IL-10-h AMSCs组、空质粒组TGF-β1阳性率明显下调,7d、14d均为IL-10-h AMSCs组下降最明显(P0.05)。MMP-1结果:建模后1d、3d,各组见MMP-1阳性率逐渐升高,与空白组比较有统计学差异(P0.05);除空白组外四组之间差异无统计学意义(P0.05)。建模后7d,与模型对照组比较,h AMSCs、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组阳性率明显增高,且IL-10-h AMSCs组增高最明显(P0.05),14d,各组阳性率均下降,模型对照组、h AMSCs、空质粒-h AMSCs组阳性率下降明显,三组之间无差异(P0.05),但模型对照组、h AMSCs、空质粒-h AMSCs组与IL-10-h AMSCs组差异明显(P0.05)。TIMP-1结果:1d、3d、7d,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs组、模型对照组含量逐渐升高,各时间点与空白组相比差异明显(P0.05)。7d时,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs组与模型对照组相比差异明显(P0.05),IL-10-h AMSCs组与空质粒组、h AMSCs组相比差异明显(P0.05)。14d,模型对照组含量明显增高,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs组含量增高不明显,与模型对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。6、ELISA法和q PCR检测小鼠背部创面及创缘组织结果显示TGF-β1含量及mRNA相对表达量:结果可见空白组正常小鼠皮肤组织TGF-β1较低,1d、3d、7d模型对照组TGF-β1含量逐渐增高,7d达峰值后逐渐开始下降,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs组较模型对照组1d、3d的TGF-β1明显增高,且IL-10-h AMSCs组升高更明显,7d时IL-10-h AMSCs组与空质粒-h AMSCs组、h AMSCs组TGF-β1明显含量减少,IL-10-h AMSCs组减少最多,且三组含量均少于模型对照组,以上差异具有统计学意义(P0.05)。提示IL-10-h AMSCs在创面愈合过程的1d、3d促进创面分泌TGF-β1,7d后可以抑制创面中的TGF-β1的分泌,使其减少。MMP-1浓度及mRNA相对表达量:结果可见空白组正常小鼠MMP-1含量较低,其余四组的MMP-1含量1d、3d逐渐增高,7d达峰值后逐渐开始下降。h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒组较模型对照组1、3、7d的MMP-1含量少,且IL-10-h AMSCs组含量最少,7d,四组MMP-1含量均增高,且IL-10-h AMSCs组与空质粒-h AMSCs组、h AMSCs组、模型对照组相比,MMP-1含量明显多于以上三组,差异具有统计学意义(P0.05)。结果表明正常皮肤MMP-1表达极低。IL-10-h AMSCs可以增加创面MMP-1含量。TIMP-1浓度及mRNA相对表达量:结果可见空白组正常小鼠TIMP-1含量较低,其余四组的TIMP-1含量逐渐增高,1、3、7d,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空质粒-h AMSCs组较模型对照组的TIMP-1含量高。差异具有统计学意义(P0.05),14d,模型对照组含量明显增高,余三组含量增高不明显,h AMSCs、IL-10-h AMSCs组、空质粒-h AMSCs组与空白组及模型对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。结果表明正常皮肤TIMP-1表达极低。IL-10-h AMSCs可以在创面中增高TIMP-1含量。TIMP-1/MMP-1比值:1d、7d时,各组比值相差不大,3d时,IL-10-h AMSCs比值大于模型对照组,差异具有统计学意义,(P0.05);14d,IL-10-h AMSCs比值小于模型对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1、创面形成后局部移植IL-10-h AMSCs可通过先升高后降低的方式影响创面TGF-β1表达,促进创面愈合,控制创面的炎症反应,改善创面愈合质量。2、IL-10-h AMSCs在创面愈合中可下调TIMP-1/MMP-1比值,改善创面愈合质量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R641

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