两性霉素B脂质体在雌雄大鼠的急性毒性和毒代动力学研究

发布时间：2018-01-20 10:52

本文关键词： 两性霉素B脂质体急性毒性毒代动力学 HPLC-MS 性别差异　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：两性霉素B(Amphotericin B,AmB)属多烯类广谱抗真菌抗生素,适用于敏感真菌所致的深部真菌感染。但是注射用两性霉素B毒性较大,尤其是肾毒性,长期使用会导致肾及循环系统损害,极大地限制了它的应用,故人们考虑将其制成脂质体制剂,以改变其在体内的分布来降低毒性。脂质体两性霉素B(Liposomal Amphotericin B,L-AmB)是两性霉素B的一种独特的脂质制剂,已使用近二十年来治疗广泛的真菌感染。两性霉素B的抗真菌活性在其掺入脂质体双层后保留,但其毒性显着降低。在前期的新药研发中我们发现,在雌雄大鼠静脉注射L-AmB引发的急性毒性存在显著的性别差异,表现为雌性大鼠的毒性反应较雄性明显严重,这种毒性反应的性别差异原因不明,迄今未见报道。因此,本实验选取不同来源的两性霉素B脂质体来验证雌雄大鼠的急性毒性反应的性别差异,并建立在生物样品中两性霉素B的HPLC-MS测定方法,研究L-AmB在雌雄大鼠毒代动力学特征,以期阐明急性毒性的性别差异,为两性霉素B的临床安全用药提供重要参考信息。第一部分两性霉素B脂质体在雌雄大鼠的急性毒性实验目的:1比较不同来源的两种两性霉素B脂质体急性毒性反应的性别差异。2比较两性霉素B普通制剂急性毒性反应的性别差异。方法:1 L-AmB急性毒性:SD大鼠分为四个剂量组,分别为0.5、1.0、2.0和4.0 mg·kg~(-1),每个剂量组大鼠各30只,雌雄各半。按每1 kg体重给予1毫升由华北制药厂提供的两性霉素B脂质体(为1号,即L-AmB-1)进行单次尾静脉注射给药,尾静脉注射完成后观察并记录大鼠出现的中毒症状及死亡情况。SD大鼠24只,随机分为两个剂量组2.0和4.0 mg·kg~(-1),每组12只,雌雄各半,按每1 kg体重给予1毫升自上海新先锋药业购买的两性霉素b脂质体(为2号,即l-amb-2)进行单次尾静脉注射给药,尾静脉注射完成后观察并记录大鼠出现的中毒症状及死亡情况。2amb普通制剂急性毒性:sd大鼠40只,随机分为四个剂量组0.5、1.0、2.0和4.0mg·kg~(-1),每组各10只,雌雄各半,按每1kg体重给予1mlamb普通制剂单次尾静脉注射,注射完成后观察并记录sd大鼠出现的毒中毒症状及死亡情况。结果:1脂质体急性毒性:1.1l-amb-1:大鼠单次静脉注射l-amb-1葡萄糖注射液后,在0.5mg·kg~(-1)剂量组雌雄大鼠均未出现中毒症状;在1mg·kg~(-1)剂量组内15只雌性大鼠中有5只出现中毒反应,15只雄性大鼠有3只出现中毒反应,且雌性动物的中毒反应明显重于雄性动物,毒性症状于给药后20-30分钟出现,包括轻微的痉挛、俯卧、呼吸困难,在给药后60分钟后逐渐减轻直至消失。在2mg·kg~(-1)剂量组内,雌雄大鼠均出现明显的毒性反应,15只雌性受试动物中3只在给药后2-4小时死亡,表现为痉挛抽搐、俯卧、呼吸困难、最终因呼吸衰竭而死亡。雄性反应症状表现为痉挛抽搐、俯卧、呼吸困难,但毒性反应程度较雌性动物稍轻,并未出现死亡,其他动物的毒性反应症状在给药4小时后逐渐减轻直至消失。在4mg·kg~(-1)剂量组内,雌雄大鼠均出现严重的毒性反应,15只雌性受试动物中11只在给药后0.5-1小时死亡,15只雄性受试动物中5只在给药后0.5-2小时死亡,其他动物的毒性反应症状在给药4-6小时后逐渐减轻直至消失。每个剂量组中雌雄大鼠各30只,分三批,每一批每个剂量下雌雄各5只动物。对三组动物死亡率进行统计分析,雌雄大鼠死亡率存在显著差异(p0.05),雌性大鼠死亡率明显高于雄性。1.2l-amb-2:大鼠单次静脉注射l-amb-2葡萄糖注射液后,在2mg·kg~(-1)剂量组内,雌雄大鼠均出现明显的毒性反应,症状于给药后20-30分钟出现,包括痉挛抽搐、俯卧、呼吸困难,雌性动物的中毒反应重于雄性。在4mg·kg~(-1)剂量组内,雌雄大鼠均出现严重的毒性反应,6只雌性受试动物中4只在给药后0.5-1小时死亡,6只雄性受试动物中2只在给药后0.5-2小时死亡,其他动物的毒性反应症状在给药4小时后逐渐减轻直至消失。2amb普通制剂:大鼠单次静脉注射amb普通制剂葡萄糖注射液后,在0.5mg·kg~(-1)剂量内,雌雄大鼠均出现毒性反应,症状包括痉挛抽搐、俯卧、呼吸困难,雌雄大鼠的毒性反应相似,于给药后20-30分钟出现,给药后4小时症状逐渐减轻直至消失。在1mg·kg~(-1)剂量组内,雌雄大鼠均出现明显的毒性反应,表现与脂质体相似,雌性与雄性各有3只在给药后2-4小时死亡。在2、4mg·kg~(-1)剂量组内,实验动物出现严重的毒性反应,所有受试动物在给药后0.5-2小时全部死亡。小结:1不同来源的l-amb在单次静脉注射给药后其急性毒性均表现出性别差异,即雌性的毒性反应明显重于雄性。急性毒性的主要反应表现是神经毒性,据此推测其急性毒性的靶器官是中枢神经。2单次尾静脉注射amb普通制剂在雌雄大鼠体内急性毒性反应不存在性别差异。第二部分两性霉素b脂质体在雌雄大鼠体内的毒代动力学研究目的:建立血液及组织中两性霉素b的hplc-ms测定方法,应用该方法进行毒代动力学研究,测定药物在血浆和组织中的分布,为动物毒性反应的性别差异提供实验依据。方法:1分别取相应的生物基质,进行hplc-ms测定两性霉素b的方法学验证,包括特异性、检测限与定量限、基质效应、精密度与准确度、提取率与回收率。2血浆样品处理:sd大鼠48只,体重180-220g随机分为3个剂量组1、2和4mg·kg~(-1),每组16只,雌雄各半。三组大鼠按1ml/1kg分别单次尾静脉注射给予l-amb-1葡萄糖注射液。分别在给药后的0.08、0.16、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、24和48小时进行内眦取血,分离血浆,-20℃保存备用。按照hplc-ms方法测定血浆中两性霉素b的浓度。3组织样品处理:sd大鼠,36只,随机分为3组,每组12只,雌雄各半。三组大鼠均以2mg·kg~(-1)的剂量按1ml/1kg单次尾静脉注射给予l-amb-1葡萄糖注射液。分别在给药后的0.5、1.0和2.0小时麻醉动物,取心、肝、肾、脑组织,用生理盐水洗净表面血污,滤纸拭干,称重,-20℃保存备用。hplc-ms法测定组织中盐两性霉素b的浓度。结果:1 HPLC-MS方法学建立和验证:成功建立并验证了两性霉素B在血浆和组织中的HPLC-MS毒代动力学分析方法。2血药浓度:静脉注射L-AmB-1后,拟合的药-时曲线,1 mg·kg~(-1)剂量组为二房室模型,2和4 mg·kg~(-1)剂量组为非房室模型。毒代动力学参数中雌性受试动物的AUC、T1/2明显高于雄性,同时雌性受试动物的CL明显低于雄性。3组织分布:药物在肝脏和肾脏的分布最多并且表现出性别差异,雌性的药物含量明显高于雄性。药物在心脏的含量很低且没有明显的性别差异。在脑中含量在给药后随时间的增加而增加,雌性为10.05、18.43、30.06mg×h×mL~(-1),雄性为9.16、13.96、19.58mg×h×mL~(-1)。小结:毒代动力学结果显示,由于雌性动物体内两性霉素B的暴露量更高,半衰期更长以及血浆清除率更低,造成了L-AmB-1的急性毒性表现出明显的性别差异即雌性的毒性反应明显重于雄性。在组织中的分布情况表明,药物在肝脏和肾脏分布最多,雌性明显高于雄性,并且在脑中的含量在一直在随时间而增加,雌性显著高于雄性。结论:两性霉素B脂质体大鼠静脉单次注射急性毒性存在显著的性别差异,即雌性动物的中毒反应显著重于雄性动物,毒代动力学结果表明,这种性别差异是由于雌性大鼠体内药物清除较慢,致体内暴露量增大,包括脑在内的重要脏器药物分布显著高于雄性所致。
[Abstract]:In this study , we found that the acute toxicity induced by intravenous injection of L - AmB in male and female rats was significantly lower than that of male rats . The distribution of drug in liver and kidney was significantly higher than that in males .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R965

【参考文献】