丙泊酚与七氟烷对缺血再灌注损伤的保护作用的机制研究

发布时间：2018-01-24 17:48

本文关键词： STAT3 miR-17 内皮细胞缺氧复氧损伤丙泊酚七氟烷肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和意义缺血再灌注损伤是临床实践中比较多见的病理生理过程,如果处置不合理,容易对患者多个脏器造成损伤,影响预后,严重者甚至会危及其生命。血管是组织细胞与血液进行营养交换的重要场所,血管损伤也是缺血再灌注损伤中的基本病理改变,内皮细胞是血管和组织之间的重要屏障。事实上,在器官的缺血再灌注损伤中,血管损伤通常最先发生,血管内皮细胞的凋亡也先于组织细胞。血管内皮细胞的损伤,导致血管内炎性细胞以及炎性分子直接进入组织,加重组织细胞的损伤。研究血管内皮细胞的缺血再灌注损伤分子机制,具有非常重要的临床价值。肝脏的损伤可以由多种病理途径引起,如肝脏缺血再灌注和肝脏硬化。肝脏缺血再灌注损伤的发生主要有以下两个部分：一是由于肝脏本身在缺血过程中发生的损伤,二是当已经存在缺血的肝脏发生血液再灌注时产生的损伤。已有研究证实,肝脏缺血再灌注涉及多种不同过程,包括缺血时的三磷酸腺苷(ATP)耗竭、乳酸堆积和酸中毒,活性氧、脂质和氮类等自由基的生成,钙离子超载以及中性粒细胞活化。当肝细胞发生缺血及缺氧时,线粒体内有氧呼吸受到抑制,发生无氧呼吸,肝细胞内ATP大量减少、迅速耗竭,依赖ATP的各种细胞活动停止；代谢终产物不能够迅速排出体外,细胞内乳酸堆积,造成pH值降低和代谢性酸中毒,从而引起肝细胞损伤。丙泊酚(propofol)是临床常见的一类静脉麻醉用药,近年来研究证实,丙泊酚在术中参与了多种脏器的保护,如脑、肺脏、脊髓、心血管、肾脏等。目前,尽管丙泊酚保护脏器的分子机制已有研究,但是其确切的保护机制依然不明确,参与这一过程的新的基因和蛋白还有待发现,这对于缺血再灌注损伤保护类药物的开发和临床应用具有重要的价值。miRNA-17分子是miR-17-92家族成员之一,最初被发现在肿瘤中表达异常升高而受到关注,目前研究证实,miRNA-17是重要的一个癌基因,与多种肿瘤的发生发展关系密切。另一外面,miRNA-17与心脏、肺脏、脑等多种组织细胞的发育关系密切。研究发现,缺氧能够引起血管内皮细胞中miRNA-17的表达改变,提示miRNA-17可能在缺血再灌注中发挥生物学功能。STATs是一种可以和目标基因调控区DNA结合的蛋白家族,STATs在人和哺乳动物中已经有7个成员被发现,分别是：STAT1、STAT2、STAT3、STA4、 STAT5a、STAT5b、STAT6。很多细胞外信号可以激活JAK-STAT通路,调节目标基因的表达,进而起到多种作用。STAT3信号通路与细胞凋亡有关,抑制STAT3活性可诱导凋亡。丙泊酚广泛用于临床麻醉,研究报道其对心脏、脑和下肢的缺血再灌注损伤具有保护作用。类似地,丙泊酚也广泛用于肝移植,因为肝衰竭不会对其代谢产生显著影响。已有学者证明,吸入性麻醉药在肝脏缺血之后可保留肝脏血流和细胞功能。七氟烷是20世纪90年代广泛开始应用的一种卤素麻醉剂,目前已成为常用的全身麻醉用药。与其他吸入麻醉剂类似,七氟烷可通过降低Ca2+浓度并干扰钙稳态而直接舒张支气管平滑肌,从而发挥支气管扩张剂的作用。因此,本项目拟研究miRNA-17在丙泊酚调控血管内皮细胞保护作用中的分子机制；同时构建肝脏缺血再灌注大鼠模型,探讨丙泊酚和七氟烷是否对肝脏缺血再灌注具有保护作用及其具体的作用机制。第一部分丙泊酚通过调控miR-17激活STAT3信号通路抑制人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤目的研究miRNA-17在丙泊酚诱导的血管内皮细胞保护作用中的分子机制。方法1.体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),构建缺氧复氧的细胞模型；根据处理因素的不同,分为H/R组, H/R+propofol 150μmol/L组,H/R+miR-17 inhibitor组,H/R+miR-17 scramble组(NC)；2.利用Real-time PCR技术检测丙泊酚对血管内皮细胞中miR-17表达水平的影响；3.利用CCK-8实验检测丙泊酚对HUVECs保护作用；4.利用Annexin-V/PI双染法及流式细胞术证实miR-17抑制剂对凋亡的抑制作用；5.利用Western blot检测丙泊酚处理和miR-17表达后Bax和Bcl-2的变化；6.利用Western blot检测miR-17对STAT3表达的影响,利用Western blot分析miR-17模拟物转染后STAT3蛋白的变化；7.通过双荧光素酶报告实验鉴定miR-17与STAT3 mRNA的结合。结果1. Real-time PCR分析发现,HUVECs和H/R HUVECs中的miR-17表达无明显改变。但是,经丙泊酚处理后,正常细胞和H/R细胞中的miR-17表达均显著下降。这些结果表明,miR-17对H/R导致的血管内皮细胞损伤可能具有保护作用；2.CCK-8试验表明,H/R处理之后,丙泊酚处理使细胞活力显著上调,转染miR-17抑制剂使H/R处理之后的细胞活力上调。这些结果表明,给予丙泊酚对HUVECs有H/R保护作用,而且该保护作用可能依赖于miR-17的表达调控;3. Annexin-V/PI双染法及流式细胞术证实miR-17抑制剂对细胞凋亡的抑制作用,使用miR-17抑制剂或阴性对照(scramble对照)质粒转染HUVECs,并用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色,然后在H/R处理之后采用流式细胞术进行分析。与未经H/R处理组相比,给予丙泊酚后的凋亡细胞数量明显减少。与转染scramble对照质粒的细胞相比,转染miR-17抑制剂的细胞中凋亡细胞的数量也发生类似的减少；4. Western blot测定了凋亡相关蛋白,H/R处理之后给予丙泊酚处理时,凋亡蛋白Bax发生显著下调,而抗凋亡蛋白Bcl-2发生上调。此外,缺氧处理后进行miR-17抑制剂转染时,这些蛋白质具有相同的表达趋势；5. STAT3活化可引起细胞周期控制调节异常以及凋亡基因异常表达,从而导致细胞凋亡。因此,miR-17可能通过靶向作用于STAT3而抑制内皮细胞凋亡。为了明确miR-17是否可以直接靶向作用于HUVECs中的STAT3,进行了Western blot分析,发现miR-17模拟物转染后STAT3蛋白的表达显著下调；6.将STAT3的3'-UTR克隆到pMIR-REPOR荧光素酶对照载体。然后制备突变的报告基因,使其STAT3 3'-UTR中的miR-17种子匹配序列发生突变。该STAT33'-UTR和miR-17共转染使相对荧光素酶活性显著下降。相反,与NC相比,突变STAT3 3'-UTR不受miR-17过表达的影响。这些数据表明,STAT3 mRNA和miR-17之间存在直接的相互作用。结论丙泊酚能够改善缺氧复氧后脐静脉内皮细胞的血管内皮损伤,这个保护作用的机制之一可能是miR-17下调介导的STAT3信号通路激活。第二部分丙泊酚和七氟烷两种麻醉药对肝脏缺血/再灌注损伤的作用目的探讨并比较丙泊酚和七氟烷对肝脏缺血/再灌注的作用及其确切的分子机制。方法1.选用雄性SD大鼠,建立肝脏缺血再灌注的模型；2.采集肝脏组织,10%福尔马林固定24小时以上,包埋后制作4μm厚度切片,然后进行HE染色,在光镜下进行组织病理学检查,评估炎症和组织损伤情况；3.使用生化分析仪检测大鼠血清中的血清ALT、AST和LDH的水平,验证丙泊酚和七氟烷对这三种酶的作用；4.利用联免疫吸附试验检测大鼠血清中炎性介质(TNF-α,、 IL-1、IL-10和IL-6)的浓度和水平,以明确丙泊酚和七氟烷是否可以降低这些细胞因子的水平；5.利用qRT-PCR技术检测TNF-α、 IL-1、IL-6和IL-10等炎性细胞因子mRNA的表达,进一步明确丙泊酚和七氟烷对这些细胞因子的水平的作用；6.利用Western blot检测了NF-κB的水平,观察炎性细胞因子释放是否受NF-κB调控；7.利用特定检测试剂盒评估大鼠肝组织中氧化应激生物标志物MDA和NO以及抗氧化标志物SOD的水平；8.利用TUNEL法检测肝组织细胞凋亡情况；9.利用Western blot检测丙泊酚和七氟烷对Bcl-2家族、AKT和p38-MAPK信号通路的影响,探究丙泊酚和七氟烷的抗凋亡机制；10.利用行免疫组化染色检测丙泊酚和七氟烷对肝脏I/R损伤大鼠的p-Akt和p-p38表达的影响。结果1.肝组织损伤的组织学评估使用HE染色进行。Suzuki评分显示IR组的病理改变为IR诱导的重度损伤；类似地,丙泊酚和七氟烷降低了Suzuki评分,即减轻了损伤程度；2.血清中释放的几种标志物评估肝脏损伤,包括AST、ALT和LDH, I/R组中这些酶的水平明显升高,但是丙泊酚和七氟烷均使这三种酶的漏出减少；3. TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性因子在肝脏I/R损伤的病理生理中发挥关键作用。为了明确丙泊酚和七氟烷是否可以降低这些细胞因子的水平,使用ELISA和qRT-PCR分别测定了它们在肝组织中的水平和mRNA表达。丙泊酚和七氟烷均使TNF-α、IL-1和IL-6的释放以及mRNA表达降低,并增加了IL-10的水平。但是,丙泊酚组的IL-1释放显著低于七氟烷组,而TNF-a释放显著高于七氟烷组；4. Western blot检测了NF-κB的表达,观察炎性细胞因子的释放是否受NF-κB调控。I/R诱导的P65磷酸化水平升高受到丙泊酚和七氟烷处理的抑制。相反,丙泊酚和七氟烷上调了IκBα的表达。丙泊酚对NF-κB表达呈现出更强的抑制作用；5. 测定了MDA、SOD和NO的水平,以评估丙泊酚和七氟烷对氧化应激的影响。MDA和NO的水平于缺血再灌注时显著增加,而丙泊酚和七氟烷处理可使其恢复。与I/R组相比,丙泊酚和七氟烷处理组的SOD水平下降；6. TUNEL法检测显示I/R组的凋亡率显著增加,而丙泊酚和七氟烷均使凋亡减轻；7. Western blot实验证实：丙泊酚和七氟烷可抑制缺血性肝损伤中Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的下调,而降低Bak和Bax等促凋亡蛋白的上调,最终使诱导肝组织凋亡的细胞色素C和caspase蛋白表达下调；8. Western blot实验证实：丙泊酚增强了AKT的磷酸化而抑制了BAD的磷酸化。七氟烷显著降低了肝脏缺血再灌注诱导的p38磷酸化,而AKT和BAD的总表达或磷酸化未发现改变；9. 免疫组化显示丙泊酚增加了AKT磷酸化,而七氟烷抑制了p38的磷酸化。结论及意义丙泊酚和七氟烷均可通过调节多种重要的病理生理过程,如细胞因子释放的改变、伴ROS生成改变的氧化应激以及凋亡,而对肝脏缺血/再灌注损伤发挥保护作用。这些过程相互关联,为保护作用的确切机制提供了线索。该领域仍需进一步研究,从而为丙泊酚和七氟烷的临床使用提供必要信息。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614.24

【参考文献】