DDR1-MMP9通路在大鼠脑缺血损伤所致的血脑屏障破坏中的作用和机制研究

发布时间：2018-01-29 19:20

本文关键词： 盘状结构域受体1 基质金属蛋白酶-9 脑缺血再灌注损伤血脑屏障大鼠　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景卒中（尤其是缺血性脑卒中）仍然是威胁我国国民健康的主要杀手之一，在我国，脑卒中具有高发病率、高患病率、高致残率和高死亡率的特点；同时，脑卒中给社会带来了沉重的经济负担和巨额的财政支出[2]。目前，临床中最主要治疗卒中的方式是组织型纤溶酶原激活物（tPA）；然而，由于治疗时间窗窄[1]，使得这唯一有效的治疗干预方式的使用受到了极大的限制。因此，认识卒中发生的机制并针对性地研究新而有效的干预措施已是迫在眉睫。血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液与中枢神经系统之间的一道物理屏障，其主要功能是监管出入物质的转运，保护中枢神经系统免受各种内外因素的伤害；因此，BBB在维持大脑内环境的稳态中起着重要的作用[3]。然而，血脑屏障的损伤将会导致神经炎性反应、神经退行性变以及中枢神经功能的障碍。引起血脑屏障破坏的因素很多，包括基质金属蛋白酶（matrixmetallop roteinases, MMPs）、氧化应激、血管生成因子、炎性细胞因子、自身抗体、白细胞粘附因子、免疫细胞的浸润和各种病原体，它们的共同特点是均会导致血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达的减少、基底膜的降解和血脑屏障通透性的增加，进而加重脑损伤的程度[4]。 MMPs是一组Zn2依赖性内肽酶，能够降解和重塑细胞外基质。各种外源性损伤因子或大脑的缺血再灌注损伤均会引起炎性反应和氧自由基的增加，这些损伤因子激活MMP9、MMP3等基质金属蛋白酶类后降解BBB的基底膜成分和细胞外基质，进而引起血脑屏障的破坏；而血脑屏障的破坏又可反过来加重脑损伤程度，导致血管源性脑水肿以及一系列的脑损伤[5]。在MMPs中，基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）与脑梗死程度关系密切[6]。脑缺血/再灌注损伤后表达上调的MMP9通过降解基底膜，破坏血脑屏障，加重脑损伤；因此，抑制脑缺血损伤后MMP-9的表达、保护血脑屏障的完整性可能是减轻脑损伤的重要措施。盘状结构域受体1（discoidin domain receptor l，DDR1），属于圆盘状的结构域受体酪氨酸激酶类（DDRs），它的主要功能是调控胶原的合成及降解、酶活性并监控细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)成分的形成；有研究表明，ECM的破坏在肿瘤组织的浸润和转移中同样也起着非常关键的作用[7]。以往许多肿瘤研究已证实DDR1可通过与各型胶原（I-V型）的结合介导MMP9的表达和活性，在肿瘤细胞的转移和扩散中起到了非常关键的作用[8,9]；但是DDR1和MMP9的关系在中枢神经系统的研究较少，而在脑缺血损伤后并未见报道；所以我们通过建立大鼠的MCAO模型来观察脑缺血再灌注损伤后DDR1的表达改变及其对MMP9的影响和机制，并观察下调DDR1的表达水平对血脑屏障通透性的作用，为缺血性脑损伤后血脑屏障的破坏提供一个新的有效的治疗手段。实验一、脑缺血再灌注损伤后DDR1蛋白及其磷酸化水平的表达改变目的：采用大鼠的在体MCAO模型观察脑缺血及再灌注损伤后DDR1及其磷酸化水平的表达改变情况。方法：健康成年雄性SD大鼠55只，随机分为假手术组（sham）、缺血再灌注组（MCAO）、siRNA处理组(siRNA)和siRNA错配组(siRNA-c)。sham组仅分离血管，不进行线栓阻塞；MCAO组在大脑中动脉阻塞2小时,分别于再灌注3h，6h,12h,24h后1.5倍的正常麻醉剂量下处死大鼠(每个时间点n=5)；siRNA组在MCAO前3天侧脑室转染DDR1-siRNA，于缺血2h再灌注24h后处死大鼠；siRNA-c组在MCAO前3天侧脑室转染DDR1-siRNA-c，于缺血2h再灌注24h后处死大鼠。各组均取同侧缺血半暗带组织进行Western blotting检测DDR1及其磷酸化水平的表达改变(n=5)；另外,各组于腹腔灌注并固定后连续冰冻切片，使用DDR1和NeuN的免疫荧光双标来观察DDR1在神经元上的表达改变(n=5)。结果：与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤后DDR1蛋白的表达及其磷酸化水平伴随再灌注时间的持续明显上调，并于再灌注24h达到高峰；而通过侧脑室注射DDR1的siRNA后，DDR1蛋白的表达及其磷酸化水平相比MCAO组明显下调,（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）；另外，注射siRNA-c组DDR1的表达同MCAO组相比无明显改变（P＞0.05）。结论：脑缺血再灌注损伤后DDR1及其磷酸化水平随着再灌注损伤时间的持续均有不同程度的升高。实验二、抑制DDR1的过表达对MMP9表达和活性的影响目的：采用大鼠在体MCAO模型来观察抑制DDR1的过表达后MMP9的表达水平和酶蛋白活性的改变情况。方法：健康成年雄性SD大鼠35只，体重280～320g，分组和处理方法同实验一，各组取同侧缺血半暗带组织进行Western blotting和明胶酶谱分析法检测MMP9的酶蛋白表达及其酶活性改变。结果：正常情况下，，MMP9的表达和活性极低，脑缺再灌注损伤后MMP9的表达和活性伴随再灌注时间的持续明显上调，并于再灌注24h达到高峰。侧脑室注射siRNA抑制DDR1的表达后，MMP9的表达和活性明显下调（P0.01MCAO vs.sham；P0.01siRNA vs.MCAO）；注射siRNA-c组MMP9的表达同MCAO组相比无明显改变（P＞0.05）。结论：DDR1siRNA可降低脑缺血损伤后缺血半暗带区MMP9的表达和酶活性。实验三、下调DDR1蛋白表达及其磷酸化水平对血脑屏障通透性的影响目的：采用大鼠在体MCAO模型观察下调DDR1及其磷酸化的表达对血脑屏障通透性、脑梗死容积和神经行为学的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠112只，体重280～320g，分组方法同实验一。MCAO后，大脑中动脉阻塞2小时,分别于再灌注24h后处死大鼠。采用伊文思蓝染色评估血脑屏障的通透性(n=12)、干湿比重法测定脑水含量(n=8)、TTC染色法来评估梗死后的容积百分比(n=8)。结果：和假手术组相比，脑缺血再灌注损伤后，大鼠的血脑屏障通透性（伊文思蓝含量：9.464±0.5342μg/g；脑水含量：83.73±0.44%）升高，神经行为学评分（6.250±0.8864）降低，脑梗死容积(44.75±3.778%)增加；与MCAO组相比，siRNA组大鼠的血脑屏障通透性（伊文思蓝含量：4.614±1.142μg/g；脑水含量：79.76±1.05%）降低，神经行为学（12.63±1.408）明显改善，脑梗死容积（22.45±3.018%）明显减少（P 0.05），（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）。结论：抑制DDR1及其磷酸化的过表达可有效减轻血脑屏障通透性增加，减少脑梗死容积，改善神经行为学评分。小结我们的研究结果显示脑缺血再灌注损伤后DDR1及其磷酸化水平明显上调、BBB通透性增高、脑梗死容积增大、神经行为学评分降低。抑制DDR1的过表达可减轻MCAO后BBB的通透性，并可减轻缺血再灌注后的脑损伤。进一步的研究发现，DDR1蛋白可能是通过上调其下游分子MMP9的表达量及酶活性造成缺血后BBB通透性增高和脑损伤的。本研究为我们提供了一个新的思路即：特异性地抑制DDR1的过表达或许就有可能起到保护血脑屏障、降低缺血性卒中的发生率的作用。本课题为脑缺血后BBB损伤的研究拓宽了思路，下一步我们将从DDR1调控MMP9的中间分子机制入手，进一步揭示DDR1-MMP9通路在脑缺血后BBB损伤中发挥的作用。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

【参考文献】