Nrf2在液压冲击脑损伤抗神经细胞凋亡中的作用

发布时间：2018-01-30 03:34

本文关键词： Nrf2 基因敲除液压冲击脑损伤神经功能缺损评分脑组织含水量神经细胞凋亡 Caspase-3 Caspase-12 TUNEL　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：观察Nrf2基因敲除小鼠液压冲击脑损伤后水肿脑组织中凋亡蛋白Casepase-3、Casepase-12表达变化和神经细胞凋亡改变，探讨Nrf2在液压冲击脑损伤中所发挥的抗神经细胞凋亡作用。方法：用雄性Nrf2基因正常和基因敲除小鼠制作液压冲击脑损伤模型。选取成年小鼠32只，其中Nrf2+/+、Nrf2-/-各16只，体重约28-32g，随机分为4组：Nrf2+/+对照组（Nrf2+/+NC组，n=8）、Nrf2+/+损伤组（Nrf2+/+TBI组，n=8）和Nrf2-/-对照组（Nrf2-/-NC组，n=8）、Nrf2-/-损伤组（Nrf2-/-TBI组，n=8）。其中，对照组仅头颅开窗不进行液压冲击损伤；损伤组头颅开窗并常规制作液压冲击脑损伤模型。各实验组小鼠于24h后采用神经功能缺损评分（NSS）方法进行评分，然后过度麻醉，断头，留取组织标本。迅速从损伤区前缘取重约50mg水肿脑组织，采用干湿重法测量脑组织含水量；经损伤区切成约4mm薄层冠状脑组织，用多聚甲醛固定，采用HE染色观察组织形态学变化；免疫组织化学染色方法检测Caspase-3、Caspase-12的表达；原位末端荧光标记（TUNEL）法检测神经细胞的凋亡情况；取损伤区域后缘脑组织采用免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测Caspase-3、Caspase-12蛋白含量。结果： 1神经功能缺损评分脑损伤后，小鼠出现了神经功能缺损症状。与对照组（NC）比较，损伤各组（TBI）在损伤后24h神经功能评分明显高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；但是Nrf2+/+TBI组（5.25±0.89）与Nrf2-/-TBI组（5.88±1.36）比较无统计学意义（P0.05）。 2组织学观察 Nrf2+/+NC组和Nrf2-/-NC组肉眼观察：脑组织软脑膜完整表面光滑，脑沟及脑回清晰可见，脑表面及颅底无挫伤、出血、充血等表现。镜下观察：脑组织细胞结构完整，排列有序，核膜完整，核仁蓝色淡染。 Nrf2+/+TBI组和Nrf2-/-TBI组肉眼观察：可见打击侧皮层局部挫伤，脑沟回存在积血，切面观察可见皮层下有散在点状出血，严重者可见脑室内出血。镜下观察：挫伤灶周围细胞出现水肿且水肿程度明显，胞浆淡染，部分出现空泡样变性伴胶质细胞增生。 3脑组织含水量测定采用Elliot公式对小鼠脑组织含水量进行测定。与对照组相比，损伤各组小鼠脑组织含水量明显增高；Nrf2+/+NC组（78.37±0.18）与Nrf2-/-NC组（78.32±0.13）比较无差别（P0.05），Nrf2+/+TBI组（81.55±0.40）与Nrf2-/-TBI组（82.89±0.20）之间有明显差别（P0.05）。 4免疫组化技术检测Caspase-3和Caspase-12表达 Nrf2+/+NC组和Nrf2-/-NC组小鼠Caspase-3和Caspase-12阳性细胞很少，Nrf2+/+TBI组和Nrf2-/-TBI组小鼠则明显增多。与Nrf2+/+NC组比较，Nrf2+/+TBI组动物挫伤灶周围脑组织内Caspase-3（28.892±5.865），Caspase-12（28.619±2.547）阳性细胞明显增多，且染色也较深（P0.05）；与Nrf2-/-NC组比较，Nrf2-/-TBI组动物挫伤灶周围脑组织内Caspase-3（56.884±5.819），Caspase-12（51.196±4.563）阳性细胞数量增多，且染色也加深（P0.05）；与Nrf2+/+TBI组相比，Nrf2-/-TBI组动物挫伤灶周围脑组织Caspase-3，Caspase-12阳性细胞同样明显增多（P0.05）。 5TUNEL法检测神经细胞凋亡 Nrf2+/+NC组和Nrf2-/-NC组TUNEL阳性细胞很少，Nrf2+/+TBI组和Nrf2-/-TBI组TUNEL阳性细胞表达均较对照组明显增多，且Nrf2-/-TBI组（59.30±9.90）明显高于Nrf2+/+TBI组（31.11±5.31），具有统计学意义（P0.05)。 6Western Blot测定Caspase-3和Caspase-12蛋白表达情况 Nrf2+/+NC组和Nrf2-/-NC组小鼠Caspase-3和Caspase-12蛋白表达较少，但Nrf2+/+TBI组和Nrf2-/-TBI组小鼠表达明显增多。与Nrf2+/+NC组比较，Nrf2+/+TBI组动物挫伤灶周围脑组织内Caspase-3（0.8857±0.0226），，Caspase-12（0.6327±0.0080）明显增加，差异有统计学意义（P0.05）；与Nrf2-/-NC组比较，Nrf2-/-TBI组动物挫伤灶周围脑组织内Caspase-3（1.0894±0.2479），Caspase-12（1.0290±0.1421）也明显增高，差异有统计学意义（P0.05）；与Nrf2+/+TBI组相比，Nrf2-/-TBI组动物挫伤灶周脑组织的Caspase-3，Caspase-12蛋白表达显著增多，差异有统计学意义（P0.05）。结论： 1野生型（Nrf2+/+）小鼠液压冲击脑损伤后水肿脑组织内Caspase-3和Caspase-12表达增多，神经细胞凋亡加重，提示液压冲击脑损伤后Caspase-3和Caspase-12上调表达，诱导神经细胞凋亡。 2液压冲击伤后Nrf2基因敲除型（Nrf2-/-）小鼠脑损伤后Caspase-3和Caspase-12表达和神经细胞凋亡明显高于野生型（Nrf2+/+）小鼠，表明Nrf2基因可通过抑制Caspase依赖凋亡途径，发挥抗神经细胞凋亡的神经保护作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15

【参考文献】