马索罗酚和丹参酮ⅡA对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经系统的抗氧化应激作用

发布时间：2018-02-04 12:07

  本文关键词： 多发性硬化 EAE 马索罗酚 丹参酮ⅡA Nrf2 HO-1 MDA　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种主要病理特征为中枢神经系统白质脱髓鞘的自身免疫疾病，好发病于中青年人，多发于女性。由于患者常遗留神经功能缺损，造成生活工作上的不便，甚至丧失工作能力，给个人、家庭和社会带来巨大的损失，因此科研工作者一直在寻找有效的治疗药物。本实验利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）小鼠来进行研究，大多数研究人类多发性硬化的学者都认为EAE是理想的动物模型，已有研究证实莱菔硫烷对EAE小鼠有神经保护作用，这种保护作用可能是通过激活了Nrf2/ARE通路，使机体对氧化应激的抵抗能力增强。但莱菔硫烷不能应用于人体，我们查阅文献发现甲二氢愈创木酸、又称为马索罗酚（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA）和丹参酮ⅡA（TanshinoneⅡA）这两种Nrf2/ARE通路的激活剂，其中马索罗酚以往曾作为食物的防腐添加剂使用，丹参酮ⅡA是已在临床使用的药物，将这两种药物作为实验干预药物，为临床用药进行初步筛选。与以往实验在造模当天即给予干预药物不同，本实验模拟患者“发病-就诊-治疗”的诊治过程，在小鼠出现神经功能缺损症状后才给予干预药物，更具有临床实践意义。本实验研究了马索罗酚和丹参酮ⅡA对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用，以及这种保护作用的作用机制，从个体、细胞、分子角度初步探讨这两种药物应用于多发性硬化的临床治疗的可能性，从而为临床治疗提供新的思路，初步筛选药物。 方法： 1分组：入选的小鼠为健康雌性C57BL/6小鼠、8-10周龄、体重为18-20g，共27只小鼠，将其随机分为DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组，每组各9只。 2制备EAE小鼠模型所使用的药物：使用无菌的生理盐水将MOG35-55稀释成5mg/ml，加入等体积弗氏完全佐剂，使其比例为1∶1，从而使结核杆菌的最终浓度为4mg/ml充分乳化。使用乙醚麻醉后固定小鼠，在小鼠脊柱旁双侧分四点进行皮下注射乳化混合物各0.025ml，每只小鼠共0.1ml,于免疫当天（第0小时）腹腔注射500ng PTX及第二天（第48小时）再次腹腔注射等量PTX，每只小鼠共1000ng PTX。 3干预处理：小鼠自发病（评分≥1分）当天，DMSO组每只每日腹腔注射5%DMSO1ml/mg（5%二甲基亚砜即DMSO是配置NDGA及丹参酮ⅡA溶液的溶剂），NDGA组每只每日腹腔注射NDGA溶液10mg/kg，丹参酮ⅡA组每只每日腹腔注射丹参酮ⅡA溶液20mg/kg。 4神经系统功能评分：由两名观察者选用双盲法，逐日早8∶00和晚16∶00两次，对各组小鼠进行神经功能评分。至DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组小鼠发病后20天。神经功能评分选用Weaver’s（15）评分标准，该标准较5分法及7分法更为细致。 5脑组织MDA含量测定：按照每只小鼠处死的时间，断颈处死小鼠，在冰盘上取出脑组织，迅速剥除硬脑膜，在冰盘上将脑组织分为额极、脑室周和小脑三部分，选取脑室周围脑组织，用4摄氏度生理盐水洗去血液，滤纸吸干，称取重量，按照1:9的比例加入4摄氏度生理盐水，超声匀浆,设定2000r/min，在4摄氏度下，共离心15分钟，抽取上清液，置于-80摄氏度保存，待测。测量时严格按照丙二醛试剂盒说明书操作。 6脑组织表达Nrf2、HO-1含量测定：按照每只小鼠处死的时间，水合氯醛麻醉后，固定小鼠，进行左心室穿刺，使用生理盐水灌出血液，使用4%多聚甲醛固定组织，固定2小时后取脑组织。将脑组织浸泡在多聚甲醛中为充分固定脑组织，将脑组织在多聚甲醛中浸泡24小时，行石蜡包埋，以5um厚度切取组织切片，进行免疫组化染色，之后使用光学显微镜观察阳性细胞，并计数。 结果： 1临床表现： 神经功能评分：DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组分别为2.50±0.40、1.25±0.29、1.33±0.19，NDGA组及丹参酮ⅡA组与DMSO组对比差异具有统计学意义（P0.05）。 2脑组织中MDA含量：DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组在发病20天时含量分别为41.05±8.23、23.28±3.02、27.03±3.51（单位为nmol/mgprot），NDGA组及丹参酮ⅡA组与DMSO组对比差异具有统计学意义（P0.05）。 3脑组织中Nrf2表达量：DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组在发病20天时Nrf2阳性细胞计数分别为19.13±2.81、84.41±3.48、76.15±3.18（单位为个/高倍视野），NDGA组及丹参酮ⅡA组与DMSO组对比差异具有统计学意义（P0.05）。 4脑组织中HO-1表达量：DMSO组、NDGA组、丹参酮ⅡA组在发病20天时HO-1阳性细胞计数分别为21.46±2.86、86.04±11.22、83.00±8.76（单位为个/高倍视野），NDGA组及丹参酮ⅡA组与DMSO组对比差异具有统计学意义（P0.05）。 结论： 1NDGA和丹参酮ⅡA可以减轻EAE小鼠的神经功能损伤。 2NDGA和丹参酮ⅡA可能是通过抗氧化对EAE小鼠起到神经保护作用。 3NDGA和丹参酮ⅡA的抗氧化作用可能是因为激活了Nrf2通路，使HO-1表达增加。
[Abstract]:Objective: multiple sclerosis (multiple sclerosis MS) is one of the main pathological features of central nervous system white matter demyelination autoimmune diseases, incidence in young people, more to female. Because patients often left neurological defect, resulting in the life and work, and even the loss of ability to work, to person, cause huge loss of family and society, so researchers are looking for effective drug treatment. This experiment using the experimental autoimmune encephalomyelitis (Experimental autoimmune, encephalomyelitis, EAE) mice to study, most of the studies of human multiple sclerosis scholars believe that EAE is an ideal animal model, research that sulforaphane has neuroprotective effect on EAE mice, this protective effect may be through the activation of the Nrf2/ARE pathway, enhance the body resistance to oxidative stress but ability. Sulforaphane can not be applied to the human body, we found a literature two hydrogen nordihydroguaiaretic acid, also known as horse Solo (Nordihydroguaiaretic acid, NDGA phenol) and tanshinone A (Tanshinone II A) activation of the two Nrf2/ARE pathway, which Maso Lo had used as food preservative, tanshinone A is already in clinical use of the drug, the two drugs as experimental drug intervention, were screened for clinical medication. In the previous experimental and modeling on the day of the intervention process simulation of different drugs, patients "morbidity treatment - treatment of the experimental treatment, neurological function in mice after treated drug intervention, has more clinical practice significance. This experiment studied the neuroprotective effect of horse solo phenol and tanshinone A on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice, and the protective effect of machine From the perspective of individuals, cells and molecules, we preliminarily discussed the possibility of clinical application of these two drugs for multiple sclerosis, so as to provide new ideas for clinical treatment, and initially screen drugs.
Method锛，

本文编号：1490169