X-射线照射后4T1肿瘤细胞释放的外泌体对体内外肿瘤增殖、迁移的影响及其作用机制研究

发布时间：2018-02-08 16:51

本文关键词： 外泌体 4T1细胞株小鼠骨髓来源的巨噬细胞髓源性抑制细胞小鼠肺单个核细胞 X-射线　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:放疗是肿瘤治疗的有效方法之一,目前约有一半的肿瘤患者依赖放疗。但放疗也存在一些问题,如单独放疗很难根除肿瘤,甚至在一些情况下还会造成肿瘤的播散或转移。某些实体肿瘤经一定剂量的射线照射后,容易发生上皮间质转化(EMT),形成循环肿瘤细胞(CTCs),使肿瘤转移风险增加。CTCs相当于肿瘤的“种子”,合适的微环境对CTCs的募集及定植至关重要,而免疫失衡状态的微环境显然有利于CTCs的定植与生长。肿瘤来源的外泌体(tumor derived exosomes,TD-exosomes)是由肿瘤细胞释放的直径为30-150nm的内吞囊泡,通过携带蛋白质、DNA、RNAs及mi RNAs等信息分子参与细胞间的联系。本实验以小鼠乳腺癌细胞系(4T1)及其荷瘤小鼠为模型,观察4T1细胞经X-射线照射后分泌的外泌体对4T1生长和迁移的影响及其对小鼠巨噬细胞的作用,并探讨4T1经X-射线照射后分泌的外泌体对肿瘤迁移的可能机制。方法:1 X-射线照射诱导小鼠乳腺癌4T1细胞凋亡和EMT转化1.1体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞,采用不同剂量的X-射线(0Gy、10Gy、20Gy、30Gy)照射,24h后收集细胞,PE-Annexin V和7-AAD标记细胞,流式细胞术观察4T1细胞的凋亡情况。1.2 4T1细胞经不同剂量的X-射线(0Gy、10Gy、20Gy、30Gy)照射,24h后收集细胞,Western blot检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白Vimentin、N-Cadherin、E-Cadherin。2 X-射线局部照射促进4T1荷瘤小鼠肺转移取雌性6周龄Balb/c小鼠,随机分为三组,正常对照组,荷瘤组,X-射线照射荷瘤组。小鼠于右侧第四对乳腺脂肪垫接种1×106个4T1细胞,两周后,X-射线照射荷瘤组的小鼠接受X-射线(20Gy)照射瘤灶,10天后将所有小鼠处死。称量肺重观察肺转移情况;取左肺上叶,通过病理切片、HE染色观察肿瘤肺转移情况;取右肺,机械法分离肺组织提取单细胞悬液,流式细胞术观察小鼠肺内MDSCs(CD11b+Gr-1+)、巨噬细胞(CD11b+F4/80+)数。3 X-射线照射的4T1促进4T1-GFP增殖取对数生长期的4T1细胞,接受0Gy、10Gy、20Gy、30Gy X-射线照射后,用含0.02%EDTA的胰酶消化,每个照射剂量组的细胞调整细胞密度为3×105个/孔,置于6孔板,每组置3个复孔。然后每孔加入1×105个4T1-GFP(带有绿色荧光)细胞,48h后,胰酶消化,收集细胞,每孔细胞加入一个流式管,用流式细胞仪检测4T1-GFP数量的百分比。4 X-射线照射后4T1细胞释放的外泌体对4T1细胞增殖、迁移的影响4.1外泌体的制备及电镜观察收集体外培养4T1细胞及经X射线照射后培养72h 4T1细胞的培养上清,差速离心法分离提取外泌体:2000rpm,10min;3000rpm,30min;11000rpm;60min;然后将上清超高速100,000×g离心16 h,以少量PBS重悬所得沉淀。最后用磷钨酸负染外泌体并在透射电镜下观察exosomes的形态,并以Nanodrop进行定量。4.2 4T1来源的外泌体对体外培养的4T1细胞增殖、迁移能力的影响通过实时无标记细胞分析仪(RTCA)、Transwell细胞迁移实验观察不同剂量X-射线(0Gy、10Gy、20Gy、30Gy)照射4T1细胞分泌的外泌体对4T1细胞增殖、迁移能力的影响。4.3 Western blot检测不同剂量X-射线(0Gy、10Gy、20Gy、30Gy)照射4T1细胞分泌的外泌体刺激4T1细胞对上皮间质转化(EMT)相关蛋白Vimentin、N-Cadherin、E-Cadherin的表达。5 X-射线照射后4T1细胞释放的外泌体对小鼠乳腺癌肺转移的影响及其可能的机制取雌性6周龄Balb/c小鼠,随机分为4组,正常对照组、PBS组、4T1/exo组、ir-4T1/exo组。实验组的小鼠经乙醚麻醉,分别经鼻吸入PBS、未经X-射线照射4T1分泌的外泌体(4T1/exo)、经20Gy剂量的X-射线照射4T1分泌的外泌体(ir-4T1/exo),每周3次,每次60μl,连续3周。三周后将每组小鼠分成2个小组。第一小组:取小鼠肺组织;第二小组:经尾静脉给3个实验组的小鼠(PBS、4T1/exo和ir-4T1/exo)注射1×105个4T1细胞。称量肺重观察肺转移情况;取左肺上叶,通过病理切片、HE染色观察肿瘤肺转移情况。分别取上述不同处理组的小鼠肺组织(左肺下叶,大约0.037g),用匀浆器进行组织匀浆,ELISA检测肺匀浆液中细胞因子CXCL1、IL-1α、G-CSF、IL-10含量。6 X-射线照射前后4T1细胞分泌的外泌体携带的细胞因子蛋白芯片技术检测X-射线照射前后(0Gy、20Gy)4T1细胞分泌的外泌体(4T1/exo、ir-4T1/exo)中包含的细胞因子。ELISA验证X-射线照射前后(0Gy、20Gy)4T1细胞分泌的外泌体中包含的细胞因子。7外泌体刺激小鼠骨髓巨噬细胞(BMDM)的培养上清对4T1细胞增殖和迁移的影响7.1 BMDM细胞的培养取Balb/c小鼠股骨腔内的骨髓细胞,用完全1640培养基培养。加入细胞因子GM-CSF刺激7天,终浓度为50ng/ml,刺激3天后补一次刺激因子。7.2外泌体刺激BMDM细胞48h,收集培养上清,通过实时无标记细胞分析仪(RTCA)、Transwell细胞迁移实验观察该上清对4T1细胞增殖、迁移能力的影响。ELISA检测外泌体刺激BMDM细胞后培养上清中细胞因子CXCL1、IL-1α、G-CSF含量的变化。7.3外泌体刺激BMDM细胞对M1、M2相关蛋白表达的影响体外培养BMDM细胞,经外泌体刺激48h,收总蛋白,Western blot检测外泌体刺激BMDM细胞对IKappa B、IKKa表达的影响。7.4外泌体刺激对BMDM细胞的p38MAPK信号分子的影响体外培养BMDM细胞,经外泌体刺激48h,收总蛋白,Western blot检测外泌体刺激BMDM细胞对细胞信号通路分子p38MAPK、p-p38表达的影响。结果:1 X-射线照射促进4T1细胞凋亡率明显增高,与未经照射的4T1细胞相比差异显著(P0.01),并且20Gy组明显高于10Gy、30Gy组的凋亡率(P0.01)。Western blot结果显示X-射线(20Gy、30Gy)使4T1 E-Cadherin表达下降(P0.05)。2 X-射线可明显降低荷瘤小鼠原位瘤的重量(P0.05),但促进肺内转移灶增多。流式细胞仪结果显示,X-射线使小鼠肺内MDSCs细胞、巨噬细胞数量增多(P0.01)。3将4T1-GFP细胞加入经X-射线照射的4T1细胞的培养体系中,与未经照射或10Gy照射的4T1细胞相比,经20Gy或30Gy照射的4T1细胞明显促进4T1-GFP细胞增殖(均为P0.05)。4利用差速离心方法得到4T1细胞分泌的外泌体,通过磷钨酸负染在透射电子显微镜下观察到直径约在30-150nm的椭圆形颗粒,中间淡染,边缘深染。5实时无标记细胞分析仪、Transwell细胞迁移实验结果显示,20Gy剂量的X-射线照射4T1细胞分泌的外泌体与未照射组分泌的外泌体相比,可明显促进4T1细胞增殖与迁移(P0.05)。Western blot结果显示30Gy剂量的X-射线照射4T1细胞分泌的外泌体与其他三组照射剂量组(0Gy、10Gy、20Gy)相比可明显下调E-Cadherin表达(P0.05)。6荷瘤小鼠肺重结果显示,与未吸入外泌体组相比,吸入外泌体的小鼠肺重明显增加(P0.01),且ir-4T1/exo较4T1/exo肺重明显增加(P0.01);肺组织病理切片结果显示,ir-4T1/exo较4T1/exo促进肿瘤肺转移。ELISA结果显示,肺组织匀浆ir-4T1/exo组CXCL1、G-CSF的含量高于4T1/exo组(P0.01)。7蛋白芯片技术结果显示,4T1/exo与ir-4T1/exo相比,细胞因子RANTES、MCP1、CXCL1含量明显增高(P0.05)。而ELISA结果显示,ir-4T1/exo中CXCL1的含量高于4T1/exo组(P0.01)。8实时无标记细胞分析仪、Transwell细胞迁移实验结果显示,ir-4T1/exo刺激BMDM细胞的培养上清与4T1/exo组相比可明显促进4T1细胞的增殖与迁移(P0.01)。ELISA结果显示,BMDM细胞经4T1/exo、ir-4T1/exo刺激后的培养上清中细胞因子CXCL1、G-CSF、IL-1α含量增多(P0.01)。9 Western blot结果显示外泌体作用BMDM细胞后NF-κB IKappa B、IKKa表达无差异;p38 MAPK磷酸化水平增加。结论:1 X-射线局部照射可促进4T1荷瘤小鼠肺转移。2 X-射线照射后4T1细胞释放的外泌体对4T1体内外的增殖或迁移有促进作用。3 X-射线照射后4T1细胞释放的外泌体刺激BMDM细胞的培养上清促进体外4T1细胞的增殖与迁移。4 X-射线照射后4T1细胞释放的外泌体可激活炎症因子相关信号通路。
[Abstract]:Objective : Radiotherapy is one of the effective methods for the treatment of tumors . Approximately half of the tumor patients rely on radiotherapy . However , there are some problems in radiotherapy , such as the difficulty in eradicating the tumor by radiotherapy alone . In some cases , it is difficult to eradicate the tumor , and even in some cases , the epithelial mesenchymal transition ( EMT ) is easy to occur , and the circulating tumor cells ( CTCs ) are formed , so that the tumor metastasis risk is increased . CTCs are equivalent to the " seeds of the tumor . The tumor derived exosomes ( TD - exosomes ) were irradiated by X - ray ( 0 Gy , 10 Gy , 20 Gy , 30 Gy ) for 24 h . The cells were collected by X - ray irradiation ( 0 Gy , 10 Gy , 20 Gy , 30 Gy ) . The proliferation and migration ability of 4T1 cells irradiated by X - ray irradiation ( 0Gy , 10Gy , 20Gy , 30Gy ) were observed by flow cytometry . The expression of cytokines CXCL1 , IL - 1伪 , G - CSF and IL - 10 in the bone marrow of Balb / c mice were measured by ELISA . The effects of the secretion of cytokines CXCL1 , IL - 1伪 , G - CSF and IL - 10 on the proliferation and migration of 4T1 cells were observed by ELISA . The results showed that X - ray irradiation promoted the proliferation and migration of 4T1 - GFP cells ( P0.05 ) . The results showed that X - ray irradiation promoted the proliferation and migration of 4T1 - GFP cells ( P0.05 ) . IL - 1伪 content increased ( P0.01 ) . 9 Western blot showed no difference in the expression of NF - 魏B IKANGB and IKK in vitro . Conclusion : 1 X - ray irradiation can promote the proliferation and migration of 4T1 cells . The exosomes released by X - ray irradiation stimulated the proliferation and migration of 4T1 cells .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.55

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