microRNA-122在对乙酰氨基酚诱导肝损伤中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-12 04:51

本文关键词： 药物性肝损伤对乙酰氨基酚 microRNAs 实时荧光定量聚合酶链反应 miRNA-122　出处：《上海医药工业研究院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及目的在药物研发过程中,药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)是药物开发终止的首要原因,也是药物上市后被撤回的主要因素。因此,药物性肝损伤已成为药物在研究与开发阶段最为关心的问题之一。目前DILI诊断的传统生物标志物有丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)和碱性磷酸酶(ALP)等。但这些指标反映的是已经发生的肝损伤,并且也仅有40%的患者在DILI的早期阶段出现异常。近年来研究比较热门的生物标志物micro RNAs(mi RNAs),尤其是肝脏组织特异表达的mi RNA-122,其特异性和敏感性均高于传统生物标志物,并且已经在临床、临床前和体外研究中得到证实。尽管多项研究均证实mi RNA-122可作为DILI的生物标志物,但其在DILI中的作用及机制尚不清楚。本研究已有一定的工作基础,如SD大鼠DILI模型的建立已完成,在此基础上旨在采用对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导的SD大鼠DILI模型以及Hep G2细胞,通过mi RNA沉默及表达技术,从整体、细胞和分子水平进一步研究mi RNA-122在DILI中的作用及其机制,为进一步确立mi RNA-122作为DILI的生物标志物提供理论依据。研究方法与结果本研究共分四个部分。第一部分:建立APAP诱导肝细胞损伤模型。通过CCK-8法检测不同浓度APAP处理48 h对Hep G2细胞生存率的影响,确定APAP的IC50和IC75分别为7.5m M和20 m M。检测7.5 m M和20 m M APAP处理3 h,6 h,12 h,24 h和48 h后对Hep G2细胞上清生化指标活性的影响,包括AST、LDH。结果显示,与溶媒对照组相比,20 m M APAP组在24 h和48 h AST升高为1.6倍和4.3倍,在6 h LDH活性升高2.0倍,从12 h开始,LDH活性持续升高到48 h。7.5 m M APAP组在48h AST和LDH活性有显著性升高,分别升高1.7倍和2.1倍。细胞上清AST和LDH在不同浓度APAP暴露后的动态变化趋势呈现出明显的时间和剂量依赖性,表明APAP诱导肝细胞损伤模型建立成功,为后续实验奠定了基础。第二部分:以APAP诱导的Hep G2细胞损伤模型为基础,从体外研究考察mi RNA-122在APAP诱导体外肝细胞损伤中的作用。Hep G2细胞给予7.5 m M和20 m M APAP,给药后3 h,6 h,12 h,24 h和48 h,提取细胞内总RNA,运用RT-q PCR方法,检测mi RNA-122表达水平。以mi RNA-122模拟剂(mi R-122 mimic)转染Hep G2细胞,用CCK-8方法检测Hep G2细胞存活率。以mi RNA-122抑制剂和模拟剂转染Hep G2细胞24 h后给予APAP处理24 h,用CCK-8方法检测mi RNA-122沉默或者高表达对APAP诱导的Hep G2细胞损伤的影响。与对照组相比,20 m M APAP组细胞内mi RNA-122表达水平给药后3 h升高2.82倍,24 h升高到2.97倍左右达到峰值,48 h几乎恢复正常水平(0.71倍)。7.5m M APAP组细胞内mi RNA-122表达水平12 h升高到2.1倍,24 h几乎恢复正常水平(1.40倍)。结果显示,与对照组相比,200 n M mi RNA-122 mimic组细胞存活率为84.4%,且有显著性差异。结果显示,与mimic NC+APAP相比,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic+APAP组细胞存活率分别降低10.3%和14.3%,且有显著性差异。结果显示,与LNA NC+APAP相比,20 n M LNA-antimi R-122+APAP组细胞存活率提高14.5%,且有显著性差异。以上实验结果表明,mi RNA-122在APAP处理后的Hep G2细胞中的表达有剂量和时间依赖性。在Hep G2细胞中,过表达的mi RNA-122显著抑制细胞存活率。在APAP诱导的Hep G2细胞损伤模型中,CCK-8实验结果证明,mi RNA-122上调能加重APAP诱导的肝细胞损伤,mi RNA-122下调能减轻APAP诱导的肝细胞损伤。第三部分:以雄性SD大鼠DILI损伤模型为基础,从体内研究考察mi RNA-122在APAP诱导大鼠体内肝损伤中的作用。雄性SD大鼠随机分为3组,每组4只,分别先尾静脉注射给予15 mg/kg LNA-antimi R-122(组3)、PBS(组2)、PBS(组1)各3天后,组3、组2、组1分别给予1250 mg/kg APAP、1250 mg/kg APAP以及0.5%CMC-Na,给药12 h后麻醉解剖、通过血清生化指标及肝脏组织病理学结果以确定mi RNA-122沉默是否会减轻或抵消APAP诱导的肝损伤。结果显示,在LNA-antimi R-122+APAP组中,血清AST活性显著低于NC+APAP组,下降倍数为1.7倍。尽管血清ALT活性下降倍数仅为1.1倍(无显著性差异),但已有下降趋势。并且在组织病理学检查中发现LNA-antimi R-122+APAP组中炎症、肝小叶中心的坏死组织显著性低于NC+APAP组。以上实验结果表明mi RNA-122下调能减轻APAP诱导SD大鼠肝损伤。第四部分:mi RNA-122在APAP诱导肝损伤作用中的潜在分子机制研究。应用mi Randa、Target Scan、mi RBase预测软件寻找mi RNA-122的靶基因,并与文献报道结果进行比较,筛选出靶基因Bcl-w。Hep G2细胞给予20 m M APAP,给药后3 h,6 h,12 h和24 h,提取细胞内总RNA。通过细胞转染50 n M,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic与mimic NC,48 h后提取细胞内总RNA。RT-q PCR检测靶基因Bcl-w的表达水平。结果显示,与对照组相比,20 m M APAP处理12 h和24 h后,可显著性降低靶基因Bcl-w的表达水平,下降倍数分别为2.0和2.3倍。与mimic NC相比,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic可显著性降低靶基因Bcl-w的表达水平,下降倍数分别为2.4和2.9倍。由此初步确认了mi RNA-122通过抑制抗凋亡基因Bcl-w参与APAP诱导的肝损伤。结论1.确认了细胞内mi RNA-122的改变与APAP诱导的Hep G2细胞损伤密切相关。2.APAP诱导的肝损伤是通过mi RNA-122的高表达来介导,且mi RNA-122通过抑制抗凋亡基因Bcl-w参与APAP诱导的肝损伤。
[Abstract]:In recent years , it has been proved that the effects and mechanisms of mi RNA - 122 on the survival rate of DILI are higher than those of traditional biomarkers . The results show that the IC50 and IC75 are 7.5m M and 20 m M respectively . The expression level of mRNA - 122 in vitro was determined by the method of CCK - 8 . The results showed that the survival rate of the cells increased by 14.5 % and 14.3 % , respectively , compared with the control group . The results showed that compared with the control group , the survival rate of the cells was increased by 14.3 % and 14.3 % , respectively . The results showed that compared with the control group , the survival rate of the cells was decreased by 10.3 % and 14.3 % , respectively . The results showed that the decrease of serum AST activity was significantly lower than that in NC + APAP group . The results showed that the expression of Bcl - w in the target gene was significantly lower than that in NC + APAP group . 1 . It was confirmed that the changes of mi RNA - 122 induced by APAP were closely related to APAP - induced liver injury .

【学位授予单位】：上海医药工业研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】