益气化瘀组方对高胆固醇血症大鼠降脂作用及作用机制研究

发布时间：2018-02-15 13:57

本文关键词： 高胆固醇血症降脂血管保护代谢组学　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的本实验以高胆固醇血症大鼠为研究对象,观察益气化瘀组方在降脂、保护肝脏及保护血管等方面的作用,并同时采用代谢组学方法,检测大鼠肝脏中的代谢标志物,分析所得到的实验数据,找出益气化瘀组方降低大鼠血脂的相关作用通路,并从代谢组学角度探讨益气化瘀组方防治高胆固醇血症的可能作用机制,为进一步的深入研究做铺垫。方法60只大鼠在动物房适应性喂养7天,之后根据随机数表法分为6组:空白组、高脂模型组、阳性药组、益气化瘀组方高、中、低剂量组,每组大鼠10只。正式开始实验之后,各组大鼠均正常饮水,除饲喂基础饲料外,空白组大鼠用蒸馏水灌胃,其余5组均用高脂乳剂灌胃。高脂乳剂配方为:20%猪油,5%胆固醇,5%蛋黄粉,1%丙基硫氧嘧啶,6%吐温-80,63%蒸馏水。灌胃剂量按照1Oml/Kg,持续3周进行造模。从第4周开始,各组大鼠仍按前法饲养。同时,使用生理盐水对正常对照组、模型组按照1Oml/Kg的剂量进行灌胃。益气化疲组分别按照相应的中药剂量进行灌胃,高、中、低剂量分别相当于生药量的18g、9g、4.5g/Kg。阳性组使用立普妥混悬液进行灌胃给药,药量为10mg/Kg,每日灌胃剂量为10ml/Kg,每日1次,连续给药4周。在末次给药后各组大鼠禁食不禁水12小时,取材前称重,采用10%的水合氯醛溶液按照0.35ml/100g的剂量,进行腹腔注射麻醉。之后进行腹主动脉取血,所取血液在室温中静置1小时之后,以3000转/分钟离心15分钟后分离血清,进行分装之后放置于-20℃冰箱中保存待测。取血之后处死各组大鼠,取出肝脏,并用肉眼观察大鼠肝脏形态,拍照留存。在生理盐水中浸涮以洗去血渍,用滤纸吸干水分之后称重。将称重的结果与体重结合,用于计算大鼠肝脏指数,计算方法为:肝指数=肝脏重量(g)/体重(g)×100%。摘取每只大鼠取肝脏左叶两小块肝脏组织(5mm×5mm×3mm),一块放入冻存管中,并立即置于液氮中冻存,另一块快速放置于4%的多聚甲醛溶液中固定。剖开大鼠胸腔,轻轻分离主动脉弓下大约1cm的大鼠胸主动脉组织,放入4%的多聚甲醛溶液中固定使用全自动生化分析仪检测大鼠血脂四项及其他血清酶类指标。对大鼠肝脏和胸主动脉进行石蜡包埋,随后进行HE染色,在光镜下分别观察大鼠肝脏及胸主动脉的病理变化。使用免疫组化的方法,检测大鼠胸主动脉sPLA2 Ⅱ a和NF-κB的表达时,并用Image Pro Plus6.0分析平均光密度值(MOD)。运用酶联免疫吸附法(ELISA)法,检测血清TNF-a,IL-6的水平。运用超高液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UHPLC-QTOF-MS),检测高脂灌胃诱导的高胆固醇血症大鼠肝脏中的代谢标志物。获取数据后依次采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA模式分析数据,最后再根据VIP值,筛选有差异的生物标志物,通过MetPA分析确定出准确的生物标志物和相关代谢通路,并对药效及模型做出评估。结果1.血清及相关酶类检测结果和肝脏形态变化与空白组相比,模型组大鼠TC、LDL-C水平显著升高(P0.01);与模型组相比,益气化瘀组方低剂量组和阳性组大鼠的TC、LDL-C水平均有所降低(PL0.01或P0.05)。与空白组相比,模型组大鼠血清ALT、AST、CRE、UREA、CK、LDH水平显著升高(P0.01);与模型组相比,益气化瘀组方各剂量组和阳性组大鼠血清的上述指标水平均有所降低(P0.01或P0.05)。肝脏病理切片显示,模型组大鼠肝细胞有脂肪颗粒浸润,而益气化瘀组方各剂量组和阳性组大鼠肝脏表现基本正常。2.大鼠胸主动脉相关炎症因子表达胸主动脉切片显示,与空白组相比,模型组大鼠胸主动脉平滑肌层排列紊乱,而益气化瘀组方各剂量组和阳性组大鼠胸主动脉结构基本正常。在抑制炎症因子表达上面,与空白组相比,模型组大鼠胸主动脉sPLA2Ⅱa和NF-κB的表达水平均显著升高(P0.01),血清TNF-a和IL-6的表达水平也显著升高(P0.01)。与模型组相比,阳性组和益气化瘀各剂量组大鼠胸主动脉sPLA2Ⅱa和NF-κB的表达水平均显著降低(P0.01或P0.05),血清TNF-a和IL-6的表达水平也有显著差异性(P0.01或P0.05)。3.肝脏组织中差异代谢物的测定通过对正负离子差异代谢产物的MetPA分析发现:模型组与空白组之间高脂乳剂造模导致的大鼠血清TC和LDL-C的升高,可能与包括叶酸一碳代谢和甘油磷脂代谢在内的代谢通路有关;益气化瘀组方低剂量组的降脂作用可能与叶酸一碳代谢通路、戊糖和葡萄糖醛酸转换通路这两条通路有关。结论益气化瘀组方能够显著降低模型组大鼠血清的胆固醇水平,同时对于高脂造成的大鼠肝肾功能的损害,也具有一定的调节作用。益气化瘀组方能够显著抑制脂肪对肝脏的浸润作用,改善大鼠胸主动脉的形态学变化,通过抑制相关炎症因子的作用,发挥较好的保护血管的作用。通过对肝脏代谢物的UHPLC-QTOF-MS检测及相关数据分析后发现,通过高脂乳剂灌胃建立的高脂模型可能与包括叶酸一碳代谢和甘油磷脂代谢在内的代谢通路有关,而益气化瘀组方低剂量组降脂作用的发挥可能与叶酸一碳代谢通路、戊糖和葡萄糖醛酸转换通路这两条通路有关。
[Abstract]:The rats were divided into 6 groups : blank group , high fat model group , 5 % yolk powder , 1 % propylthiourazine , 6 % tween - 80 and 63 % distilled water . After the experiment , the rats were divided into 6 groups : blank group , high fat model group , 5 % yolk powder , 1 % propylthiourumin , 6 % tween - 80 and 63 % distilled water . The levels of serum TC and LDL - C in rat thoracic aorta were significantly decreased ( P0.01 or P0.05 ) . Compared with blank group , the levels of serum TC and LDL - C in rat thoracic aorta were significantly decreased ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】