内皮祖细胞诱导内源性神经干细胞神经生发促进脊髓损伤修复的实验研究

发布时间：2018-02-26 05:05

  本文关键词： 内皮祖细胞 内源性神经干细胞 共培养 脊髓损伤　出处：《安徽医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：利用神经干细胞(neural stem cells, NSCs)修复脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的实验研究主要有两种方法。一种方法是通过移植外源性NSCs到损伤部位,通过外源性NSCs的增殖和分化,替代因损伤而缺失的神经元细胞,重建神经通路从而修复损伤脊髓；另一种方法是通过各种手段诱导损伤部位的脊髓内源性NSCs增殖和分化,替代因损伤而缺失的神经元细胞,重建神经通路来修复损伤脊髓。当前的研究表明将外源性NSCs移植到损伤部位实质上只是改善了损伤部位局部的内环境,最终还是通过脊髓内环境的改善从而诱导和促进脊髓内源性NSCs的神经生发来修复损伤脊髓。神经生发往往伴随着血管生发,提示血管因素在神经损伤修复的过程中占有重要的地位,有效的血管生发应该能带来脊髓微环境的明显改善,从而诱导损伤部位的神经生发。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一种能够在外周血中分离培养获得,能有效促进组织血管生发的干细胞。本实验设计分离培养SD大鼠外周血的EPCs并移植入SCI大鼠的损伤脊髓,通过改善损伤脊髓内环境诱导内源性NSCs的神经生发重建神经通路以修复损伤脊髓。研究首先分离培养大鼠外周血EPCs和脊髓内源性NSCs,然后在体外进行外周血EPCs与脊髓内源性NSCs的共培养,通过倒置显微镜观察和免疫组化方法鉴定外周血EPCs对脊髓内源性NSCs增殖与分化情况的影响并测定培养上清液的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达变化,研究其机制。接着将外周血EPCs移植入SCI大鼠模型的损伤部位,通过BBB评分、Rivlin斜扳试验观察SCI的恢复情况,通过组织学观察神经元再生情况、免疫荧光染色的方法观察脊髓内源性NSCs的增殖分化情况,鉴定EPCs对神经生发的促进作用,测定损伤脊髓VEGF的表达变化反映外周血EPCs对脊髓神经功能的修复的作用机制。为实现白体外周血EPCs诱导脊髓内源性NSCs生发有效修复SCI的临床应用打下研究基础。本研究分四个部分,在实验一中取5-7 d的SPF级新生SD大鼠,颈椎脱臼法处死,无菌条件下取出胸腰段脊髓组织,去除血管和软脊膜等多余组织后将其剪碎,过滤,离心,分离,并用NSCs培养液成功分离培养出悬浮生长的细胞球,经免疫组化鉴定能表达NSCs的特异性抗原Nestin,加入血清继续培养后能分化为带有轴突和树突的细胞,经免疫组化鉴定能表达神经元特异性抗原β-tubulin-Ⅲ,即为神经元,ELISA测定其培养7d上清液可见VEGF和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达,说明该分离培养的细胞可以确定为大鼠脊髓内源性NSCs,并能分泌VEGF和BDNF。在实验二中取体重为90-120 g的雄性SPF级SD大鼠行10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔麻醉,麻醉满意后在无菌条件下取颈部正中切口,剪开皮肤及皮下组织向两边翻开并固定,沿肌肉间隙仔细分离至暴露双层颈动脉,然后用无菌采血管取双侧颈动脉的血液,约10 ml,取血完成后立即转入超净工作台中,按照淋巴细胞分离液试剂盒的操作说明分离出单个核细胞层,离心洗涤细胞,所获得的细胞沉淀以EBM-2完全培养基重悬,以5×105/ml细胞浓度接种到含有预先FN包被过的盖玻片的24孔板中,37℃,5%CO2的恒温培养箱培养。约9d左右,细胞融合度达到约90%后传代。细胞形态镜下观察符合文献报道的铺路石样排列。经免疫组化鉴定能表达细胞表面抗原CD133及VEGFR-2,摄取Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1双阳性,说明成功分离培养出大鼠外周血EPCs。ELISA测定其培养7d上清液可见VEGF大量表达、BDNF少量表达,说明大鼠外周血EPCs可以大量分泌VEGF。在实验三中将实验对象随机分为NSCs培养对照组,EPCs与NSCs共培养组和抗VEGF组(加入VEGF抗体的EPCs与NSCs共培养组)。NSCs培养对照组：收集纯化后培养的第3代NSCs,吹打成单细胞悬液后接种于24孔培养板培养7 d,观察其生长情况,然后用5%血清诱导培养NSCs7天,观察其分化情况。EPCs和NSCs共培养组：在对照组的基础上在孔内放置24孔板Transwell,取载有贴壁原代生长良好EPCs盖玻片,EPCs置于Transwell膜上,NSCs位于Transwell膜下,培养7 d,观察NSCs生长情况,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清诱导继续培养NSCs 7 d,观察其分化情况。抗VEGF组：在EPCs和NSCs共培养组的基础上再培养液内加入VEGF抗体(200 pg/ml),培养7 d,观察NSCs生长情况,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清诱导继续培养NSCs 7 d,观察其分化情况。结果在倒置显微镜下观察可见7d时,共培养组神经球数量比对照组明显多,而且球直径明显增大,共培养组与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)；5%血清诱导培养NSCs7天后,行β-tubulin-Ⅲ免疫荧光染色,在显微镜下计算β-tubulin-Ⅲ+/细胞总数得出百分率,共培养组明显高于对照组(P0.05)。ELISA法检测各组培养7d上清液VEGF水平,发现抗VEGF组的VEGF表达明显低于共培养组(P0.05),而诱导NSCs的增殖分化能力也显著降低(P0.05)。说明外周血EPCs在体外能明显促进脊髓源性NSCs的增殖与分化并与EPCs分泌VEGF有关。在实验四中我们将4月龄的SPF级SD大鼠随机分为EPCs移植组,NSCs移植组和对照组,每组24只。术前三天至术后一周每天BrdU(50μg/g)腹腔注射,采用改良Allen's法制备大鼠SCI模型后,EPCs移植组应用Hamilton微量注射器在SCI处近端约0.5～1.0mm向脊髓内注入EPCs 5μl,细胞总数5×105/ml。NSCs移植组应用Hamilton微量注射器在SCI处近端约0.5～1.0mm向脊髓内注入NSCs 5μl,细胞总数5×105/ml。对照组应用Hamilton微量注射器在SCI处近端约0.5～1.0mm向脊髓内注入生理盐水5μl。在术后1、2、4、6周采用BBB运动功能评分系统,Rivlin斜板运动试验检测大鼠运动功能恢复情况；采用组织学观察和免疫荧光双标染色检测脊髓组织病理变化情况以及EPCs对内源性NSCs增殖分化的影响；ELISA试验检测各组脊髓组织VEGF表达的变化。结果发现,手术后2、4、6周运动功能评分EPCs移植组BBB评分明显高于NSCs移植组,差异有统计学意义(P0.05)。组织学观察示EPCs移植组脊髓结构以及神经元形态恢复较好且逐渐趋于正常,免疫荧光双标染色示EPCs移植组脊髓组织中BrdU+/MAP-2+细胞数较NSCs移植组明显增多,差异有统计学意义(P0.05),ELISA试验发现EPCs移植组脊髓组织中VEGF表达明显高于NSCs移植组(P0.05)。这些结果提示EPCs能够在体内环境中诱导内源性NSCs增殖和分化从而促进SCI大鼠运动功能的恢复并且优于NSCs移植。该作用可能与EPCs移植后通过VEGF分泌改善SCI微环境有关。综上所述,本实验成功在大鼠脊髓组织提取脊髓内源性NSCs和在外周血中分离出EPCs,外周血EPCs在体外能通过VEGF明显促进脊髓内源性NSCs增殖和分化。在SCI大鼠中移植EPCs能够诱导脊髓内源性NSCs增殖和分化,促进SCI大鼠运动功能的恢复并优于NSCs移植,该作用可能与EPCs移植后VEGF分泌的增加改善SCI微环境有关。
[Abstract]:In order to study the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of spinal cord injured spinal cord ( SCI ) , the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells in spinal cord was studied by means of reversed microscopic observation and immunohistochemical method . The expression of VEGF and brain - derived neurotrophic factor ( BDNF ) in peripheral blood of rats were determined by immunohistochemistry . The expression of VEGF in the spinal cord was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the VEGF expression of the group was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

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本文编号：1536606