不同途径骨髓间充质干细胞移植治疗阿霉素肾病大鼠的实验室研究

发布时间：2018-02-28 02:30

本文关键词： 阿霉素肾病骨髓间充质细胞细胞移植肾动脉治疗　出处：《昆明医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的分离、培养和鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),观察MSCs静脉移植和动脉移植的安全性以及在SD大鼠肾脏内的分布,探讨MSCs移植治疗慢性阿霉素肾病的可行性,并对可能的机制进行探讨,为实际临床过程中用MSCs移植的方式来治疗慢性肾脏疾病提供理论基础和实验室依据。方法1.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定。取12周龄雄性SD大鼠股骨和胫腓骨在磷酸盐缓冲液里面,用含10%胎牛血清的培养液对骨髓内腔进行全面的冲洗,将骨髓细胞的悬浮液进行收集,在其中再加入Ficoll分离液,离心30分钟,2000 r/min之后,将沉淀下来的骨髓细胞进行收集,用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)离心10分钟,以1600 r/min之后,将上清弃掉,PBS溶细胞接种在塑料培养瓶中进行接种处理,在温度为37℃,环境为5% CO2的孵箱培养。经流式细胞仪检测细胞表面型号的抗原。诱导向成骨、脂肪细胞分化以观察细胞多项分化潜能。当骨髓MSCs P4至P6细胞经过染色的标示之后,使用0.1%的胰酶进行消化,用含10%FBS的L-DMEM培养基停止消化的过程之后进行离心,用不含血清的L-DMEM培养基来制作悬浮细胞,并且将细胞浓度调整到2x106／ml备用。大鼠骨髓间充质干细胞体外标示的具体方法：取出体外培养P4至P6代的BMSCs生长,当其生长到80%融合后,放置于5%CO、2%O2、93%N2的环境中,过48小时后,造成MSCs缺氧的情况,用Ad5／F35腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染液转染,经过6小时的培养,再其中加入相等量的L-DMEN,24小时后,放置于倒置显微镜下进行观察。流式细胞仪分析MSCs表面CXCR4表达情况。2.探讨不同途径移植MSCs对阿霉素慢性肾病大鼠的影响。14周龄雄性SD大鼠72只随机分为6组,各12只：①阿霉素模型对照组(ADR组)：通过手术的方法,将SD大鼠左侧肾脏切除,之后,将4mg/kg剂量的阿霉素注射到大鼠尾静脉中,术毕,麻醉过后待大鼠自然清醒,一周后再从尾静脉给阿霉素1次(4mg/kg)。②假手术组(Sham组)：手术入路方式同ADR组,进入腹腔后分离左肾但不切除左肾,逐层缝合,术毕让大鼠自然清醒,ADR注射阿霉素时Sham组以等量生理盐水代替。③阿霉素造模+细胞经尾静脉移植组(ADR+MSCs-V组)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml经尾静脉注射,第5周从尾静脉再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。④阿霉素造模+细胞经肾动脉移植组(ADR+MSCs-A组)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml经肾动脉注射,第5周从肾动脉再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。⑤Sham+尾静脉注射MSCs组(Sham+MSCs-V组)：末次注射生理盐水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml经尾静脉注射,第5周从尾静脉再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml). ⑥Sham+1肾动脉注射MSCs组(Sham+MSCs-A组)：末次注射生理盐水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml经肾动脉注射,第5周从肾动脉再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。6组大鼠分别于末次细胞移植的第0周、移植后第1周、2周各组取4只大鼠,处死前收集24小时尿量,处死后收集血标本、肾脏、心脏、肝脏、骨髓,进行以下检查：①血标本检测血红蛋白、肾功能(血尿素氮、血肌酐)、丙氨酸转氨基酶(ALT)、天冬氨酸转氨基酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血清白蛋白、血清钠；②尿标本行24h尿蛋白定量检测；③细胞移植后第2周,ADR组、Sham组、ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组大鼠肾组织均进行苏木精-伊红(HE)染色、六铵银染色(PASM)、Masson染色,在光学显微镜下观察肾组织形态学方面的变化；④ADR组、Sham组、ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组大鼠心脏、肝脏、骨髓均做病理切片,光学显微镜下观察形态学改变。⑤免疫组化检测ADR组、Sham组、ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组大鼠肾脏AQP1, AQP2的表达,电镜观察各组大鼠肾脏超微结构。3.14周龄雄性SD大鼠84只,随机分为4组：ADR组,ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组每组各24只,Sham组12只。模型制备和MSCs用量同前,使用缺氧条件下培养并经EGFP转染液转染的MSCs。4组大鼠在MSCs移植后第1天、第7天、第14天,第30天,ADR组,ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组每组各取6只大鼠处死,Sham组取3只大鼠处死,处死后留肾脏,行以下检测：①在激光共聚焦荧光显微镜下,对显示绿色荧光的MSCs在肾脏中的分布情况进行具体的观察；②Real-time PCR法检测肾脏中SDF-1mRNA表达；③移植后第14天,Western-blotting检测肾脏中SDF-1蛋白的水平。4. 14周龄雄性SD大鼠32只,随机分为4组：ADR组,ADR+MSCs-A组,ADR+NS-A组,Sham组,各组8只。模型制备和MSCs用法用量同前,但ADR+MSCs-A组,ADR+NS-A组均采用经颈动脉途径肾动脉插管方式行肾动脉造影,然后ADR+MSCs-A组再经插管予MSCs, ADR+NS-A组则经插管予等量生理盐水(NS)替代MSCs。4组大鼠分别于末次细胞移植后的第1天、第7天各取4只大鼠处死,留血标本和肾脏,行以下检测：①血标本检测血常规,以及同时检测血肌酐与血清尿素氮；②观察4组大鼠的肾脏组织在光学显微镜下形态学发生的变化。结果1.经过酶作用消化后的原代细胞在24-48小时的时间内发生贴壁的情况,1周之后生长速度较快,以平行排列方式进行增长,在第2、第3周后能够形成70%融合的贴壁细胞层,反复传代后获得形态均一的细胞,呈梭形,流式细胞仪检测细胞表型发现细胞表达CD29、CD44、CD90等MSCs标记物,不表达CD45及CD11b。P2代细胞成骨定向需要诱导14天,后可以看见细胞之间有黑色细小颗粒,该现象提示了有矿化基质的沉积,成脂肪定向诱导需要14天,后表现出油红-O染色强阳性。P4代细胞生长速度快,放置于2%O2、5% CO2、93%N2的环境中,48小时后,细胞缺氧的情况发生,Ad5／F35腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染液进行转染,之后需要培养6小时,再加等容量的L-DMEN,经过24小时后,在倒置显微镜下细致观察荧光表达情况,发现绿色荧光表达率为75%,其表现出来的形态和正常的培养细胞并无明显差别。正常培养的BMSCs表面CXCR4表达很弱,缺氧条件下培养的BMSCs表面的CXCR4表达明显增强。2.①各时间点Sham+MSCs-V组、Sham+MSCs-A组的体重增长、血红蛋白、血尿素氮、血肌酐水平与Sham比较没有显著差异(P0.05)。②各时间点ADR组、ADR+MSCs-V组、ADR+MSCs-A组的肾功能(血尿素氮、血肌酐)、24h尿蛋白定量明显高于Sham组(P0.05)。末次注射干细胞的第0周,与ADR组比较,ADR+MSCs-A组的24h尿微量蛋白降低(P0.01)。末次注射干细胞后第1周,ADR+MSCs-A组的血肌酐较ADR组和ADR+MSCs-V组均降低 (P0.01),且24 h尿蛋白、24 h尿微量蛋白明显低于ADR+MSCs-V组(P0.01)：第2周时,尽管ADR+MSCs-A组的血肌酐较ADR组降低(P0.01),但与ADR+MSCs-V组之间的差异不再明显。③ADR+MSCs-A组和ADR+MSCs-V组大鼠的血清白蛋白水平和24h尿量较ADR组有明显提高(P0.05),而血清钠浓度和24h尿蛋白定量较ADR组有明显降低(血清钠：P0.05；24h尿蛋白定量：P0.01)。以上检测指标在ADR+MSCs-A组和ADR+MSCs-V组之间无显著差异。④Sham组肾脏的肾小球、肾间质、肾小管没有表现出明显的病变情况。ADR组肾脏的肾小管、肾小球、肾间质均有不同程度受损。ADR+MSCs-A组和ADR+MSCs-V组在肾间质炎症病理改变上较ADR组程度上更轻,范围更小。⑤与ADR组比较,ADR+MSCs-A组和ADR+MSCs-V组大鼠的血清白蛋白浓度和24h尿量增加(P0.05),血清钠浓度和24h尿蛋白定量降低(P0.05),肾脏AQP1、AQP2的表达明显降低(P0.05),ADR组大鼠肾脏超微结构呈现退行性变,MSCs移植改善了其超微结构。3.①GFP标记的MSCs移植后1天,在ADR+MSCs-V组发现分布在肾小管,在ADR+MSCs-A组除了肾小管之外,肾小球也有少量分布。之后逐渐增加,14天时最明显;②ADR组大鼠肾组织内SDF-1表达较Sham组明显增加(P0.05),并随着时间推移而逐渐增加；③经缺氧培养的异体骨髓MSCs移植后,SDF-1表达较ADR组降低,在14d有统计学意义(P0.05),但ADR+MSCs-A组和ADR+MSCs-V组之间无显著差异。4.①第1天时,与ADR组比较,ADR+MSCs-A组、ADR+NS-A组的肾功能指标和血红蛋白含量均无明显差异(P0.05)：第7天时,与ADR组比较,ADR+NS-A组的肾功能指标和血红蛋白含量仍无明显差异(P0.05),但ADR+MSCs-A组的血尿素氮和血肌酐明显降低(P0.05),血红蛋白含量明显升高(P0.05)。②光镜下大鼠肾脏病理显示,与ADR组比较,ADR+NS-A组肾小球、肾小管、肾间质损伤程度与ADR组相当,但ADR+MSCs-A组在肾间质炎症病理改变的程度上更轻,范围更小。结论1.培养的细胞为骨髓间充质干细胞,符合干细胞特征。在缺氧条件下培养,细胞表面CXCR4表达增加。2.同种骨髓间充质干细胞移植是安全的,在移植后一段时间内,MSCs经肾动脉移植的效果优于经外周静脉移植。MSCs移植可降低大鼠尿蛋白排泄,提高血清白蛋白水平,降低血钠水平,下调AQP1、AQP2的过度表达,从而保护了肾脏。3.在阿霉素慢性肾病大鼠肾组织内,SDF-1表达增加可能与骨髓间充质干细胞迁移增加有一定关系；骨髓间充质干细胞治疗阿霉素肾病的机制还有待进一步研究。4.肾动脉造影并移植间充质干细胞有利于慢性肾衰大鼠肾脏损伤的修复,该方法可以模拟临床介入肾动脉移植干细胞的方式,在实验研究中可以应用推广。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692

【参考文献】