15肽介导聚吡咯修饰纳米金对卵巢癌生长抑制及机制作用的研究

发布时间：2018-02-28 09:59

本文关键词： 光动力治疗法纳米金靶向肽 SKOV-3细胞　出处：《第三军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖道常见的恶性肿瘤,在女性生殖道肿瘤中居第2位,仅次于宫颈癌,最近五年的调查中显示其发病率较2005-2010年期间上升了6%。卵巢癌早期诊断困难,易发生转移,一旦确诊往往是中晚期,治愈率低,严重威胁患者的健康。卵巢癌对放疗敏感性低,化疗主要经过全身静脉注射或腹腔穿刺注入药物的方法,副作用大、易产生耐药性等缺点难以达到预期效果,无论何种方法即使联合辅助治疗,卵巢癌患者5年生存率仅达到32%。为降低副作用和提高治疗效果,将生物治疗和物理治疗有机相结合,利用具有生物活性的多肽分子和生物材料化学偶联的方式,使多肽分子能在某些肿瘤细胞膜或细胞的特异性表达和整合功能,从而能更有效地杀伤肿瘤细胞。该方法可用于阻断肿瘤细胞生长、转移、抑制或杀死肿瘤细胞。从而达到消除肿瘤的目的,提高卵巢癌患者的治愈率。卵巢癌主要通过淋巴管来转移,有报道称新生淋巴可促进癌细胞浸润正常组织和转移,抑制肿瘤新生淋巴管的生成将成为诊断与治疗为肿瘤的一个新的可行性方法。研究显示,VEGF-C和VEGFR-3可诱导肿瘤内部新生淋巴管的形成以及肿瘤组织周围淋巴管的扩张,我们课题组成员前期研究显示,抑制VEGFR-3的生成可显著抑制卵巢癌细胞的生长。VEGFR-3主要在肿瘤淋巴管内皮细胞表达,在肿瘤血管内皮细胞有少量表达,但在正常的淋巴管内皮细胞内基本很少表达。这或许使VEGFR-3作为卵巢癌淋巴管的靶向性治疗分子提供了新的可行性[19-22]。本课题组成员在前期研究中用四轮肽库筛选技术分析得到15肽(氨基酸序列为：SHSWHWLPNLRHYAS),在体外免疫荧光实验和ELISA检测中,该肽与VEGFR-3胞外区蛋白都有很强的亲和能力,亲和常数(2.37±1.10)×106M-1[23-24],并发现15肽与VEGFR-3结合以后能抑制淋巴管的生成；通过碘131显像技术证明标记15肽对卵巢癌具有靶向性,在肿瘤组织呈富集性聚集。然而另有学者研究发现卵巢癌细胞本身能分泌VEGF-C因子,且卵巢癌组织高表达VEGFR-3,通过干扰卵巢癌细胞自分泌和旁分泌的形式抑制肿瘤的生长和转移[251,另有研究发现在卵巢癌组织和细胞、子宫颈癌、胃癌组织和细胞、VEGFR-3高表达[26-28],因此本研究选择对VEGF-C有竞争作用的15肽,发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。2003年,Hirara等通过利用beta-catenin (ctnnb1)这种调控蛋白,该蛋白作用在膀胱癌细胞中阻碍VEGF-C的生成,从而抑制了癌细胞的扩散,可以有效的延缓患者的病情,这种通过利用生物多肽配合患者进行手术以及在放化疗等多医疗手段中的合同作用。多肽与靶向组织有特异的结合性能,但对细胞的作用局限,往往结合在细胞表面,缺乏对细胞的穿透性能,需要与其它物质连接可以增加生物学活性,纳米技术研究已深入医学、生命科学等领域。纳米金粒子直径在1-250nm,因其粒径微小,具有量子效应、表面效应和宏观热效应。利用纳米粒子的特殊优势,通过表面修饰,可以实现生物分子运载、药物导弹载体、药物包裹等,这将提升现有诊断医疗水平,实现局部病变的治疗,病变的局部给药,减少了对健康器官的损伤,极大地降低了肿瘤等疾病治疗的副作用,这些特点为开发新药提供了可能。利用纳米材料宏观热效应,将纳米材料作为光热治疗的光敏剂,在光的作用下,会让身体的癌细胞发生形变或生物分子发生变化,将导致细胞损伤和坏死,这一反应要有氧的参与,所以该种效应又称光敏化-氧化作用或者光动力疗法。其原理是通过光化学反应的作用将光能转化为分子的内能,从而使分子利用内能使细胞产生多种活性的氧分子,进而破坏细胞的亚细胞纤维结构,致使细胞出现凋亡或死亡。目前这一技术已成功应用于临床上食管癌患者、肺癌患者等肿瘤晚期患者、复发性患者的姑息性治疗,并取得了明显的疗效。由于修饰的纳米材料可在异常增生的组织肿瘤中选择性聚积,临床上对光照的波长、强度和部位进行选择,已达到最小病变组织的治疗,减少治疗的副作用。该方法特异性比较好,适用性比较强,同时毒性较低,可协同手术以提高疗效,并且选择性好、可姑息治疗、消灭隐性病灶,还能够保护重要器官功能、可以进行重复治疗,由于该方法创伤很小,所以可以减少患者的痛苦。Kelly等利用光敏效应与靶向生物分子相结合在肝肿瘤研究中均有相关报道。基于15肽与卵巢癌组织的靶向性结合和抑制作用,以及纳米金本身的光动力作用、穿透性能、表面易修饰等特点,本文利用聚吡咯修饰合成纳米金花,结合15P(SHSWHWLPNLRHYAS)靶向分子,研究其对肿瘤细胞的抑制及其杀伤作用机制。研究目的通过化学合成的聚吡咯修饰的纳米金花为光敏剂,以合成的具有与VEGFR-3竞争性结合作用的靶向多肽为媒介的新材料15肽介导的聚吡咯修饰纳米金花(Gold nanorods of 15-pentadecapeptide,15P-PPy-NPS)。探讨不同剂量光敏剂、不同激光光照时间、不同光照频率下对卵巢癌肿瘤细胞的杀伤效果。卵巢癌细胞培养和裸鼠肿瘤模型的构建以及纳米材料的生物安全性评价,研究纳米金新材料光动力肿瘤抑制率及杀伤机制。期望具有靶向作用的纳米金花新材料能为卵巢癌的临床治疗研究提供新的思路。研究方法1.合成15P-PPy-NPS并进行系列表征与鉴定采用还原氯金酸制备纳米金,用聚吡咯修饰以增大表面积,筛选花状纳米金。通过粒径比较筛选,PH值稳定性能,激光照射频率以及光热转化效率等方面评价纳米金花靶向肽的化学、物理、生物活性。通过电镜、紫外红外吸收光谱及其表征鉴定。15P是通过肽库筛选技术,经过随机4轮亲和实验筛选出的,与VEGFR3特定区域蛋白(胞外区)具有较强的亲和力,将其与纳米金花通过酰胺键共价键偶联,合成15P-PPy-NPS。2.15P-PPy-NPS体外筛选肿瘤细胞株通过MTT法、Cell scratch实验、Transwell细胞体外侵袭实验、荧光显微镜下观察15P-PPy-NPS侵入细胞实验,比较各种癌细胞株的活性、侵染性、对15P-PPy-NPS材料的敏感性及细胞生长的抑制率,从HO-8910、SW626、SKOV-3、RL95-2、HeLa229、 HeLa-S3等细胞中筛选特异细胞株。完成癌细胞对纳米金花、15肽、不同激光频率照射和时间等条件下细胞凋亡情况的检测。3.15P-PPy-NPS对动物模型光热抑制肿瘤生长用肿瘤细胞SKOV-3,使小鼠患人卵巢癌,等肿瘤大小合适时,鼠尾静脉注射光敏材料15P-PPy-NPS、NPS15肽、生理盐水,结合激光照射,一定频率下,每天记录实验鼠肿瘤增长状况,裸鼠活动状况,裸鼠进食量、对治疗的适应性等。用0.1%戊巴比妥麻醉后,取出病患部位免疫化学分析,检测肿瘤细胞凋亡状况。4.NPS和15P-PPy-NPS对内脏组织的损伤检测取15P-PPy-NPS治疗的实验鼠,激光照射后取肝、脾、肾内脏器官做石蜡组织切片,通过荧光扫描电子显微镜观测脏器细胞凋亡或死亡状况,分析15P-PPy-NPS光敏材料所带来的副作用及潜在的毒性危害。研究结果1.完成还原法氯金酸制备纳米金花,对纳米金用不同厚度的聚吡咯包被,pH值适用范围在pH1-9内分散均匀、形貌特征明显,3W/cm2的808nnm激光照射下性质稳定；合成15肽,将其与纳米金花通过酰胺键共价键偶联,质谱分析,条件筛查,光谱检测结果表明,15肽聚吡咯修饰的纳米金花偶联成功。2.镜下观察细胞加入15P-PPy-NPS材料30min后主要分布在细胞膜附近,少部分侵入细胞内,60min后进可明显的观测到材料在胞体内富集。多种妇科肿瘤细胞株对15P-PPy-NPS材料MTT敏感性表明：HO-8910抑制率为53%,SW626抑制率为53%,RL95-2抑制率为48%,SKOV-3抑制率为75%,HeLa-S3为63%,HeLa229为51%。通过Hochest33342单染结果15P-PPy-NPS+照射组的治疗结果表明细胞凋亡明显,15P-PPy-NPS+照射组的细胞凋亡率达84.93%、NPS+照射组达71.83%、15肽+照射组52.74%、15P-PPy-NPS组15.72%、15肽组16.49%、NPS组17.36%、激光照射组24.17%；空白组12.0%。3.15P-PPy-NPS对裸鼠光热治疗结果：肿瘤抑制率(%)：15P-PPy-NPS+照射组细胞23.57±2.626、NPS+照射组16.61士0.7915、15肽+照射组8.926±1.651、15P-PPy-NPS组5.883±1.625、NPS组1.584±0.5264、15肽组6.159+1.403、激光照射组1.430±1.788,空白组-18.65±3.901。各组间治疗前后体重无变化。Tunel染色和PI、Hoechst染色表明：15P-PPy-NPS+照射组细胞凋亡率达78.51%、NPS+照射组达62.10%、15肽+照射组37.48%、15P-PPy-NPS组22.5%、NPS组11.69%、15肽组19.67%、激光照射组10.02%,空白组4.09%。第一组、二组与其它各比较均有显著性差异(P0.001；P0.05)4.通过15P-PPy-NPS材料尾经脉注射实验Skov-3中瘤裸鼠,结合激光照射治疗后,取实验鼠脏器,肝脏、肾脏、脾脏等器官,经包埋处理石蜡组织切片表明15P-PPy-NPS材料注射组和空白组中肝、肾、脾中细胞凋亡率没有差异。说明材料15P-PPy-NPS对实验裸鼠在器官细胞上没有造成损害,佐证了15P-PPy-NPS光敏材料的安全性。结论本论文通过合成聚毗咯修饰纳米金花,结合多肽分子靶向性,为光动力治疗肿瘤细胞提供高效,稳定的光敏剂,利用激光照射实验鼠肿瘤为手段达到抑制甚至杀死癌细胞的目的,为恶性肿瘤的治疗提供了新思路。1.成功地合成了聚吡咯包覆6nm纳米金花,合成15肽,并将15肽和纳米金NPS偶联,通过质谱分析、紫外化学分析等手段对纳米金NPS、15肽、15P-PPy-NPS的结构,稳定性,光热转换效率等方面进行检测。为后续实验提供了材料基础。2.成功地从六种相关的妇科肿瘤细胞中筛选出在15P-PPy-NPS为光敏剂作用下能高效的杀伤癌细胞的细胞株,构建SKOV-3细胞模型。为动物模型构建提供了实验基础。3.成功构建人卵巢腺细胞SKOV-3荷瘤裸鼠模型,15P-PPy-NPS辅助激光照射抑制了肿瘤的生长,肿瘤组织切片出现大量的凋亡细胞甚至死亡细胞,这为临床光热治疗提供新型光敏剂,结合红外激光照射有效杀伤癌细胞提供了实验基础。4.对实验鼠的体重变化,进食量、活动量、外界刺激反应和解剖内脏组织肝脏、脾、肾脏用：15P-PPy-NPS+激光照射治疗后同空白组对比研究,组织切片凋亡表明内脏器官受损较小,显示了该材料进行生物治疗和光热治疗具有良好的安全性和可靠性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

【相似文献】