脉冲剪切力对血管内皮细胞ACE2的表达调节及分子机制研究

发布时间：2018-03-01 21:11

本文关键词： ACE2 剪切力内皮细胞动脉粥样硬化剪切力内皮细胞 ACE2 KLF2 AMPK　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：ACE2在脉冲剪切力调节血管内皮细胞生物学功能中的作用研究背景心脑血管疾病已成为危害人类健康的首要原因,随着我国进入老龄社会,心脑血管疾病的防治将面临严峻形势。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的主要病理基础,AS发病过程漫长,其发病机制目前尚不完全清楚。多种因素造成血管内皮细胞损伤或功能异常被认为是AS发生的始动环节,由血流产生的剪切力在调节内皮细胞功能中具有重要作用。人体血管一直暴露于搏动性血流的作用下,主要受到两种形式的机械力刺激,一种是由血液流动产生的剪切力(shear stress),一种是由心脏周期性搏动产生的牵张力(stretch)。大量研究证实,剪切力是影响内皮细胞生物学效应的主要生物力。目前对剪切力调控血管内皮细胞功能的机制已有了许多认识：内皮细胞通过细胞表面的具有感知机械信号刺激的各种受体、离子通路或特殊膜结构,将胞外机械信号转化为细胞内的化学信号,通过各种细胞骨架结构的传导,激活细胞内的各种信号通路,促进或抑制相关基因的表达,从而调节细胞功能的变化。在体内的主动脉根部、颈动脉分叉、肾动脉开口等AS好发的部位,由于血流的紊乱,内皮细胞主要受到低剪切力(low shear stress)和／或震荡剪切力(oscillatory shear stress, OSS)的作用,研究证实,这些部位的内皮细胞具有较高的炎症因子表达和细胞凋亡水平；而在比较平直的血管部位,如腹主动脉中段,内皮细胞主要受到搏动性的层流剪切力,即脉冲剪切力(pulsatile shear stress, PSS)的作用,具有较低的炎症因子表达水平和细胞周期转换水平。肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotension system, RAS)过度激活与AS的发生密切相关,血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ, AngⅡ)是RAS的主要效应分子,具有促进内皮细胞凋亡和促进炎症因子表达的作用,目前拮抗AngⅡ的作用已成为冠心病的基础治疗之一。血管紧张素转化酶2(angiotension converting enzyme 2, ACE2)是RAS系统的一个重要成员,具有促进AngⅡ降解生成血管紧张素1-7(angiontesion-(1-7))的作用。近年来的研究表明,ACE2主要通过Ang-(1-7)与其特异性受体MAS结合,发挥抗炎、抗氧化应激等内皮保护作用。研究证实,过表达ACE2能够抑制血管AS的发生和进展。研究发现,脉冲剪切力能够影响血管内皮细胞血管紧张素转化酶(angiotension converting enzyme, ACE)的表达,调节Angll的水平,然而剪切力是否同样可以影响血管内皮细胞ACE2的表达目前还未见报道。ACE2在内皮细胞中表达丰富,基于近年来对ACE2在血管内皮保护作用中的广泛研究,以及脉冲剪切力在维持血管内皮稳态中的重要作用,我们推测ACE2可能参与脉冲剪切力对血管内皮细胞生物学效应的调控。明确脉冲剪切力对血管内皮ACE2表达的影响,有利于进一步理解RAS在AS发生过程中的作用具有重要意义。研究目的1.在体外细胞水平,明确脉冲剪切力对血管内皮ACE2表达的影响。2.在体外细胞水平,明确ACE2在脉冲剪切力调节内皮细胞功能中的作用。3.在整体动物水平,观察剪切力对血管内皮细胞ACE2表达的影响。研究方法1.细胞培养严格无菌条件下获得新生儿脐带,采用胰酶消化法得到原代人脐静脉内皮细胞(]HUVECs),用含20%胎牛血清的M199培养基在37℃、5%C02细胞培养箱中进行培养,传代后改用含10%胎牛血清的M199培养基继续培养,并利用细胞免疫荧光法进行内皮细胞鉴定,实验选取4-8代内皮细胞。2.剪切力干预将HUVECs接种至铺有Ⅰ型鼠尾胶原的载玻片上,在完全培养基中培养,待细胞生长至90%时,利用Flexcell剪切力仪分别给予细胞脉冲剪切力(PSS, 12±4dyn/cm2, 1Hz)和震荡剪切力(OSS,0±4 dyne/cm2, 1Hz)刺激不同的时间(0、1、3、6、12、18小时),实验结束后收集细胞,利用qRT-PCR和Western blot检测ACE2的mRNA及蛋白水平,明确不同形式的剪切力对内皮细胞ACE2表达的影响的时间趋势。3.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)采用Trizol法提取细胞总RNA,使用TAKARA实时荧光定量PCR试剂盒进行反转录和PCR,目的基因扩增引物由上海吉玛生物公司合成。4.蛋白免疫印迹(Western blot, WB)细胞干预结束后收集细胞,利用酶裂解法收集胞浆蛋白,每个样本均进行蛋白定量检测,加入适量loading buffer后煮沸5分钟,然后经过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭等步骤,孵育一抗4℃过夜,次日孵育二抗,TBST洗膜后采用增强型ECL发光液显影并观察结果。5.细胞免疫荧光分别给予体外培养的HUVECs以PSS、OSS刺激12小时,连同静止对照组细胞一起,经过免疫染色固定,打孔、封闭,孵育一抗、二抗,染核,封片等步骤,然后在荧光显微镜下观察不同组的细胞ACE2的表达差异6. AngⅡ与Ang-(1-7)水平检测剪切力刺激细胞结束后,收集胞浆蛋白,测定各个样本蛋白浓度,利用ELISA试剂盒分别检测胞浆蛋白中AngⅡ与Ang-(1-7)的水平。7.NO水平测定剪切力干预细胞结束后,收集细胞,提取胞浆蛋白,采用碧云天NO定量检测试剂盒测定NO的含量。8.细胞转染利用阳离子脂质体2000,转染不同浓度的ACE2 siRNA,转染48小时后收集细胞,提取胞浆蛋白,利用WB检测目的基因的蛋白水平,评价干扰效果,选择合适的转染浓度进行后续的细胞功能学实验。9. BrdU法检测细胞增殖使用美国罗氏公司的BrdU试剂盒检测ACE2在剪切力调节内皮细胞增殖中的作用,实验步骤按照试剂盒说明书进行。接种HUVECs在载玻片上,根据实验目的给予相应的预处理,然后再给予脉冲剪切力刺激,实验结束后各组细胞经过BrdU标记、乙醇固定、anti-BrdU孵育、免疫荧光二抗孵育、DAPⅠ染核等步骤,在免疫荧光显微镜下观察内皮细胞的增殖情况,计算BrdU阳性细胞率。10. TUNEL法检测细胞凋亡利用美国Millipore公司的TUNEL试剂盒检测内皮细胞的凋亡情况,具体步骤按照试剂盒说明书进行。接种HUVECs细胞至载玻片上,经过相应的预处理后给予脉冲剪切力刺激,实验结束后各组细胞经过免疫染色固定液固定、乙醇/乙酸混合液-20度孵育、TDT酶孵育等步骤,在荧光显微镜下观察内皮细胞凋亡情况,并计算TUNEL阳性细胞率。11. En face组织免疫荧光选取10-12周的C57/BL6小鼠,深度麻醉后行甲醛灌注、固定,手术纤维镜下分离主动脉弓及胸腹主动脉,仔细去除血管周围脂肪结缔组织,纵向剖开血管,封闭后共同孵育ACE2及CD31抗体,4℃过夜,次日用不同荧光标记的二抗37℃调节下共同孵育,封片剂封片后在共聚焦显微镜下观察染色结果。12.统计学分析所有数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示,两组之间比较采用非配对t检验,多组之间的比较采用单因素方差分析,使用SPSS软件进行数据分析,p0.05认为有显著统计学差异。研究结果1.脉冲剪切力(PSS)上调]HUVECsACE2的表达分别给予体外培养的HUVECs不同时间(0、1、3、6、12、18小时)的PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)和OSS (0±4 dyne/cm2,1Hz)刺激,qRT-PCR及WB分别检测ACE2的mRNA及蛋白水平。结果显示：与静止对照(0小时)相比,PSS干预3小时后ACE2 mRNA的表达水平即明显升高,一直持续到18小时,这种上调作用仍显著(p0.05); ACE2的蛋白表达水平自PSS刺激6小时后开始明显上调,一直持续到18小时,高峰在12小时(p0.05)。而与静止对照相比,OSS自3小时开始上调ACE2 mRNA的表达,直到12小时,而OSS干预18小时后,ACE2 mRNA水平恢复静止对照组的水平；WB结果显示,在OSS刺激6小时后,ACE2蛋白水平开始升高,一直持续至12小时,而18小时后ACE2蛋白水平即降至静止对照水平。为进一步明确PSS和OSS对ACE2表达的影响,分别给予体外培养的HUVECs以OSS和PSS刺激12小时,利用qRT-PCR, WB以及细胞免疫荧光的方法检测内皮细胞ACE2的表达情况。结果显示：与静止对照比较,PSS和OSS刺激12小时后,ACE2的mRNA及蛋白表达水平均明显升高(p0.05)；而与PSS比较,OSS则明显减少内皮细胞ACE2的表达(p0.05)。此外,与静止对照组及OSS组比较,PSS刺激HUVECs12小时后,细胞排列方向具有显著的一致性,沿培养基流动的长轴排列,而静止培养组与OSS刺激组,细胞排列方式则较为杂乱无序。2.PSS通过上调ACE2调节HUVECs中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平给予体外培养的HUVECs PSS干预12小时,ELISA法测定细胞浆中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平。结果显示：与静止对照组比较,PSS显著上调细胞中Ang-(1-7)的水平(p0.05),而抑制AngⅡ的水平(p0.05)；分别转染ACE2siRNA和阴性对照(NC)siRNA后,再给予PSS干预12小时,结果显示ACE2siRNA明显抑制PSS诱导的Ang-(1-7)水平增高,并促进AngⅡ的水平(p0.05)；在PSS刺激前,预孵育ACE2抑制剂DX600,结果显示：与预孵育DMSO比较,DX600明显抑制PSS诱导的Ang-(1-7)水平增高,并促进AngⅡ的水平(p0.05)。3.ACE2参与介导PSS促进血管内皮细胞NO的产生为明确ACE2是否参与PSS调节血管内皮细胞NO的生成,体外培养的HUVECs经过转染ACE2 siRNA或预孵育Ang-(1-7)抑制剂MLN-4760处理,再给予PSS刺激12小时,检测细胞浆中NO水平,结果显示：PSS明显增加胞浆中NO的含量,而转染ACE2 siRNA或MLN-4760预处理能够显著抑制PSS诱导的NO生成；另外,WB结果显示,与静止对照比较,PSS组细胞eNOS和p-eNOS (Ser1177)的表达水平明显升高(p0.05),而转染特异性siRNA抑制ACE2的表达后,再给予细胞PSS刺激12小时,PSS诱导的eNOS、 p-eNOS的表达水平也受到明显抑制(p0.05)；4.ACE2参与PSS抑制内皮细胞粘附因子的表达预先给予体外培养的HUVECs TNF-a (100nM)刺激12小时以诱导炎症反应,然后给予12小时的PSS刺激或继续静止培养12小时。结果显示,与静止对照组比较,PSS明显抑制粘附因子VCAM-1、MCP-1的蛋白表达水平(p0.05)；而在转染ACE2 siRNA的细胞中,与转染NC siRNA组细胞相比,VCAM-1、MCP-1的表达显著升高(p0.05)。5.ACE2在PSS抑制HUVECs增殖中发挥作用与静止对照组比较,PSS刺激组细胞的BrdU阳性率明显降低(p0.05),而转染ACE2 siRNA组细胞的BrdU阳性率较转染NC siRNA组细胞明显升高(p0.05)；WB结果显示,PSS明显上调HUVECs p21的蛋白水平,而通过siRNA抑制ACE2表达后,PSS上调的p21蛋白水平得到显著抑制(p0.05)。6.ACE2不参与PSS抑制]HUVECs的凋亡TUNEL结果显示,PSS组细胞较静止对照组细胞凋亡阳性率明显降低(p0.05),而转染ACE2 siRNA后,细胞凋亡阳性率较NC siRNA组无明显差异(p0.05)；利用WB检测各组细胞cleaved-caspase3的表达情况,结果显示转染ACE2 siRNA对PSS抑制的cleaved-caspase3的表达无明显影响(p0.05)。7.ACE2在小鼠腹主动脉内皮细胞中的表达显著高于主动脉弓小弯侧由于小鼠主动脉弓小弯侧的血流紊乱,该处内皮细胞主要受到OSS的作用,而腹主动脉段的血流方向具有较好的一致性,该处内皮细胞主要受到PSS的作用,利用En face组织免疫荧光染色分别检测上述部位内皮中ACE2的表达,结果显示ACE2在小鼠腹主动脉内皮细胞中的表达显著高于主动脉弓小弯侧(p0.05)。结论(1)脉冲剪切力显著上调血管内皮细胞ACE2的表达。(2)ACE2参与调节脉冲剪切力促进血管内皮细胞NO的合成和抑制细胞增殖。(3)ACE2参与调节脉冲剪切力的抗炎作用,但不参与脉冲剪切力调节细胞凋亡的作用。脉冲剪切力上调血管内皮细胞ACE2表达的分子机制研究研究背景血管内皮细胞一直暴露于剪切力的作用下,由方向稳定的血流产生的脉冲剪切力具有显著的维持血管内皮稳态,抗动脉粥样硬化形成的作用；而血管分叉处的内皮细胞,由于受到紊乱血流产生的震荡剪切力或低剪切力的作用,具有较高的氧化应激水平和炎症反应,倾向于动脉粥样硬化斑块的形成。尽管剪切力与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关,但其中具体的分子机制还不完全明确,近年来的研究亦发现越来越多的基因表达受到剪切力的调节,并参与血管内皮功能的调节以及动脉粥样硬化的发生发展。ACE2具有显著的内皮保护及抗动脉粥样硬化作用,在我们的前期研究中也发现,脉冲剪切力明显上调内皮细胞ACE2的表达水平,然而,目前我们对ACE2表达调控的分子机制还知之甚少。深入研究ACE2表达的调节机制有利于更好的了解RAS在剪切力调节内皮功能中的作用。剪切力可以在转录、转录后、翻译后等水平调节特定基因的表达。研究发现,剪切力可以通过抑制ACE启动子的活性在转录水平抑制其表达,还可以通过上调miR-143/145的表达在转录后水平抑制其表达；此外,剪切力对内皮NO产生的调节也在转录及转录后等多个层面发挥作用。作为RAS中重要的抗动脉粥样硬化基因,ACE2的表达是否也在上述多个水平受到调控还需要实验进一步证实。AMPK(AMP-activated protein kinase)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,AMPK通路是剪切力发挥内皮保护作用的关键信号通路,广泛参与了抗炎、抗氧化应激、细胞周期等多种内皮细胞生物学效应的调节。有研究表明,脉冲剪切力可以通过激活AMPK通路促进内皮细胞NO的合成和降低ROS的水平；新近的一项研究则证实,剪切力可以通过激活的AMPK通路上调内皮细胞miR-143/145的水平,后者在转录后水平抑制ACE的表达,从而拮抗AngⅡ致病的生物学作用；另外,有研究发现,在低氧等细胞应激状态下,AMPK的激动剂AICAR能够通过上调Sirtl的表达,促进ACE2的转录。由此可见,AMPK信号通路与RAS各组分之间的表达水平密切相关,作为脉冲剪切力激活的重要内皮保护性通路,AMPK通路是否参与调节PSS诱导的ACE2表达?这一问题还需进一步实验证实。转录因子KLF2(Kru"ppel-Like Factor 2)是介导脉冲剪切力维持内皮稳态,抗AS作用的关键转录因子。研究证实,PSS可通过激活AMPK-ERK5/MEF2通路上调KLF2的表达,后者大约参与调节50-70%PSS敏感基因的表达,具有显著的抗炎、抗氧化作用。在各种病理生理条件下,目前还未见KLF2与ACE2关系的报道,但是鉴于两者广泛的内皮保护作用,我们推测KLF2可能是PSS诱导ACE2表达的重要调节因子。在剪切力调节内皮细胞功能中,AMPK通路是KLF2的重要上游信号通路,因此,我们推测脉冲剪切力有可能通过AMPK-KLF2通路上调ACE2的表达。研究目的(1)明确脉冲剪切力对内皮细胞ACE2 mRNA稳定性及启动子活性的影响。(2)明确脉冲剪切力是否通过AMPK-KLF2通路上调内皮细胞ACE2的表达。研究方法1.内皮细胞培养及剪切力干预复苏前期实验冻存的HUVECs,4-7代细胞用于实验。将HUVECs接种至铺有Ⅰ型鼠尾胶原的载玻片上,在完全培养基(M199、10%FBS、100U/ml Penicillin-Streptomycin、2ng/ml成纤维生长因子)中培养,待细胞生长至80-90%时,利用Flexcell剪切力仪给予细胞脉冲剪切力(PSS,1Hz,12±4dyn/cm2)刺激。2.ACE2 mRNA稳定性检测利用放线菌酮cycloheximide (CHX, 0.1mg/ml)预处理内皮细胞30min,以阻断新的ACE2转录,然后再分别给予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)干预或静止培养0、1、3、6、12小时,收集细胞并提取细胞总RNA,利用real time PCR检测各个时间点ACE2的mRNA水平,明确PSS是否影响ACE2 mRNA的稳定性。3.ACE2启动子活性检测利用实验室前期构建的人ACE2启动子表达载体(pGL3-ACE2-promoter),与PRL-TK载体一起共转染细胞24h小时后,再分别给予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)刺激或静态培养3小时,收集细胞利用Promega双荧光素酶报告基因系统检测各个时间点ACE2启动子活性的变化。4. Western blot (WB)细胞干预结束后收集细胞,利用酶裂解法收集蛋白,每个样本均进行蛋白定量检测,加入适量5 X loading buffer后煮沸5分钟使蛋白变性,然后经过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭等步骤,孵育一抗4℃过夜,次日孵育二抗1小时,然后经过TBST洗膜后采用Millipore发光液显影并观察结果。5.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用Trizol法提取细胞总RNA,使用TAKARA实时荧光定量PCR试剂盒进行反转录和荧光定量PCR,目的基因扩增引物由上海吉玛生物公司合成。6.统计学分析所有数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示,两组之间比较采用非配对t检验,多组之间的比较采用单因素方差分析,使用SPSS软件进行数据分析,p0.05认为有显著统计学差异。研究结果1.PSS不影响内皮细胞ACE2的mRNA稳定性利用放线菌酮阻断新的ACE2合成后,再给予PSS分别刺激内皮细胞1、3、6、12小时,收集细胞蛋白后利用WB检测ACE2的蛋白水平,结果显示：与静止对照组中的对应时间点相比较,ACE2 mRNA的降解速率没有显著变化(p0.05)。2.PSS显著增强ACE2启动子的活性实验室前期构建的人ACE2启动子载体(pGL3-ACE2-promoter)长度为1908 bp；利用脂质体2000分别转染pGL3-ACE2-promoter与空载体pGL3-basic vector,24小时后给予细胞PSS刺激3小时,收集细胞,利用Promega双萤光素酶报告基因检测试剂盒测定剪切力干预组及静态对照组细胞ACE2启动子的活性变化。结果显示,对静止对照组比较,PSS显著增强内皮细胞ACE2启动子的活性(p0.05)。3.KLF2参与PSS调控内皮细胞ACE2的表达给予体外培养的HUVECs脉冲剪切力分别刺激0.5、1、3、6小时,WB结果显示KLF2的蛋白表达水平自1小时开始明显上升,持续至6小时(p0.05)；转染KLF2 siRNA抑制PSS诱导的KLF2表达,与阴性对照siRNA比较,PSS诱导的ACE2表达明显下调(p0.05)。4.Akt通路不参与PSS调节ACE2的表达给予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分别刺激0、0.5、1、2、3、6 hr,收集细胞提取胞浆蛋白,Western blot检测total-Akt及p- Akt的水平,结果显示p- Akt水平自0.5小时即达到高峰,3小时回复到静止对照水平；预先用Akt信号通路抑制剂LY294002预处理细胞30分钟以阻断Akt通路的激活,再给予PSS刺激,WB结果显示,LY294002不影响PSS诱导的内皮细胞ACE2表达(p0.05)。5. AMPK-KLF2信号通路参与介导PSS诱导的ACE2表达给予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分别刺激0、0.5、1、3、6小时,收集细胞提取胞浆蛋白,Western blot检测AMPKα2及p- AMPKα2的水平,结果显示p- AMPKα2的水平自0.5hr开始升高,lhr达到高峰(p0.05)；利用AMPK抑制剂Compound C(100uM)预处理内皮细胞1小时,然后再给予PSS刺激1、3、6小时,结果显示：与DMSO组相比较,PSS诱导的KLF2蛋白表达受到明显抑制,而ACE2的mRNA及蛋白水平亦明显下调(p0.05),这提示AMPK-KLF2通路参与PSS诱导的ACE2表达上调。结论(1)脉冲剪切力在转录水平调节内皮细胞ACE2的表达。(2)脉冲剪切力通过AMPK-KLF2途径上调内皮细胞ACE2的表达。(3)Akt通路不参与PSS调节ACE2的表达。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743;R54

【参考文献】