一种节杆菌来源的透明质酸酶的研究

发布时间：2018-03-03 20:27

本文选题：透明质酸　切入点：透明质酸酶　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：透明质酸是一种高分子酸性黏多糖,广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质中。透明质酸在炎症、创伤愈合、血管再生等方面发挥重要的作用。透明质酸分子量范围十分广泛。透明质酸的生理功能与其分子量大小和在何种情况下合成密切相关。目前商品大分子量透明质酸主要通过微生物发酵法获得,极少数来源于动物组织提取。低分子量透明质酸通过物理或者化学的方法降解透明质酸获得。这些方法反应条件剧烈,往往会破坏单糖的残基结构,同时随机降解糖苷键,因此无法获得均一的透明质酸。使用酶解法制备小分子透明质酸,条件温和,特异性降解糖苷键,可以获得高质量透明质酸,因此备受人们关注。透明质酸酶是主要降解透明质酸的一类糖苷酶。最初作为"扩散因子"被发现,之后作为药物渗透剂促进药物吸收、手术后水肿消散和局部麻醉效果等。除了动物睾丸和毒液中,越来越多的微生物已被报道可以产生透明质酸酶。但动物来源的透明质酸酶原料有限,微生物制备透明质酸酶越来越受到关注。虽然已经发现很多微生物都可以产生透明质酸酶,但酶的活性都普遍偏低,主要原因是产酶量低。本研究对菌株基因组进行了测序,通过基因组分析获得编码透明质酸酶的氨基酸序列,并使用SDS-PAGE、Native-PAGE和质谱对此序列进行了验证。并对透明质酸酶家族的活性架构进行了生物信息学分析。设计了重组载体,完成了此透明质酸酶的外源表达和重组透明质酸酶的分离纯化及酶学性质研究。最后使用荧光辅助糖电泳法对酶解产物进行了研究。1.菌株基因组测序和序列分析基因组测序的结果显示菌株基因组大小为4174362 bp,含有基因4568条。经过分析注释获得一条可能为编码透明质酸酶的基因。此基因编码的蛋白分子量约83 kDa,等电点为6.55。2.电泳和质谱对获得的编码序列进行验证首先对培养48 h的野生型菌株的发酵上清液进行超滤离心,然后进行电泳检测。SDS-PAGE结果显示在83kDa附近有蛋白条带。活性电泳检测结果表明,发酵上清液具有透明质酸酶酶活,同时只有一条活性条带,说明此菌株表达且只表达一种透明质酸酶。胞外蛋白质谱结果分析表明有29条肽段与注释出来的编码序列高度匹配,说明细菌表达了注释基因编码的蛋白。基因组分析获得的基因为编码透明质酸酶的基因。3.透明质酸酶活性架构的生物信息学分析在CAZy数据库中,透明质酸酶主要属于GH56和PL8家族。分析活性架构区域的序列与结构特征对于研究透明质酸酶的作用机理具有重要意义。本文对这两个家族的透明质酸酶活性架构的氨基酸进行了分析,并制作了活性中心序列谱。4.透明质酸酶的外源表达和纯化选取pET-28a作为载体,大肠杆菌(BL21)为工程菌。在20℃,200 rpm,1mMIPTG的条件下,构建的表达菌株(BL21)成功表达出可溶性透明质酸酶。使用不同浓度的咪唑洗脱液对镍柱进行洗脱,在100mM咪唑洗脱液洗脱时可以获得电泳纯透明质酸酶,此酶可以用于后期研究。5.重组透明质酸酶的酶学性质研究(1)温度和pH对重组HAase的影响重组透明质酸酶最适反应温度为42℃,在37℃和42℃之间酶活均很高,且稳定性较好。50℃保温10 min,酶活仅剩约10%。重组透明质酸酶最适pH为6.5,pH 5.5-8.0时,酶的稳定性较高,室温放置2 h酶活依然可以保留在80%以上。当pH大于9.0或小于4.0时,重组透明质酸酶完全失活。(2)不同浓度的NaCl和NaH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲液对酶活的影响当NaH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲液浓度为5 mmol/L时酶活最高,但是对于酶活的提升并不明显,仅提高约16%。但稍高一点的NaH2PO4-Na2HP04缓冲液对酶活产生了抑制效果,当NaH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲液的浓度达到200 mmol/L时酶活降低到80%以下。NaCl浓度为5 mmol时酶活显示最高,随着浓度的增加酶活有一定下降但总的来说添加适当的NaCl对酶活有提升作用(最高浓度只做到了 200 mmol/L)。(3)金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)对酶活具有促进作用;酶液中含有100mmol/LBaCl_2时,酶活最高(约为168%)。10 mmol/L的Cu~(2+)和Zn~(2+)可以明显的抑制酶的活性,其中Cu~(2+)可以使酶完全失活,Zn~(2+)则使酶活减少近80%。10 mmol/L的EDTA对酶活基本不产生影响,但是当浓度增加到100mmol/L,重组透明质酸酶的活性明显降低,大约减少80%。非离子型表面活性剂Triton X-100的加入对酶活产生了一定的抑制作用,但酶活的降低并不明显,2%Triton X-100室温处理酶液30 min酶活仍能保留80%以上。但是离子型表面活性剂SDS在0.5%浓度下就可以使重组透明质酸酶完全失活。(4)重组透明质酸酶的底物特异性研究重组透明质酸酶特异性降解透明质酸,不能降解硫酸软骨素、肝素和羧甲基纤维素钠。(5)重组透明质酸酶降解透明质酸的酶动力学研究重组透明质酸酶的K_m和V_(max)分别为4.985 mg/mL和0.4071 μm/mL/min。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ925

【相似文献】