富马酸二甲酯和低氧诱导因子-1α关系研究

发布时间：2018-03-07 11:09

本文选题：富马酸二甲酯　切入点：缺氧　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：研究已经表明,骨折和骨骼的失载荷(失重力)能诱导骨细胞缺氧。现已证明,其中,低氧诱导因子-1a (HIF-1a)是一种组织细胞低氧环境的分泌表达的重要分子,可以诱导多种炎性介质的表达,是机体在低氧状态下调剂机体功能的一种重要氧依赖转录激活因子,介导骨折及骨骼失载荷中多种炎性因子的释放,对于骨折愈合及骨质疏松是一种不利因素。其可以促进血管内皮生长因子(VEGF).葡萄糖受体及促红细胞生成素(EPO)生成,激活炎症因子的表达,诱导泡沫细胞的形成,调控细胞的凋亡及分化。现已证明,缺氧可以上调几个重要基因的表达,包括可以促进新血管的形成和介导炎症反应的血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-8(IL-8)。椎间盘退变亦能出现HIF-1α的高表达。富马酸二甲酯(DMF)是最近批准的用于多发性硬化症的一线治疗药物,它有良好的特征性的保护神经、保护细胞作用。DMF可以调节不同类型的细胞中的免疫系统；是一种口服片剂,人们认为它是通过降低NF-κB依赖的基因的表达起作用的。缺氧时都会发生促炎症反应和氧化应激,但是,有关DMF在缺氧时的生理作用,尤其是对HIF-1α的表达和功能的调节方面的信息在过往研究中却鲜有报道。本研究中,我们期待证明DMF是一种新型的HIF-1α表达功能抑制剂。进而对于骨折、骨质疏松、椎间盘退变的治疗提出-种新的思路。我们实验分成两部分来进行：一、富马酸二甲酯抑制成骨细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及其功能。富马酸二甲酯对椎间盘髓核中低氧诱导因子-la分泌及表达的影响。第一部分富马酸二甲酯抑制成骨细胞缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)的表达及其功能目的：探讨富马酸二甲酯(DMF)在调节成骨细胞HIF-lα表达和功能中所起的功能和作用。方法：在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和链霉素(P/S)的α-基础培养基(α-MEM)中培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1(克降14)。缺氧处理前分别在蛋白酶体抑制剂MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, ALLN)存在和不存在的情况下,用范围在10-100μM之间的不同浓度的DMF处理细胞。然后分别在1%或21%氧张力下进行不同时间的预处理(1-24小时),用含有0.1% FBS和1%P/S的a-MEM更换培养基。对于环境(21%)氧张力实验,细胞在湿润的培养箱中,37℃,95%空气,5% CO2的条件下培养。对于缺氧实验,细胞在湿润的培养箱中,370C,5% CO2,氧张力降到1%,补充N2的条件下培养。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)合成的cDNA对MC3T3 El细胞中VEGF和IL-8的表达进行研究。使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫沉淀和Western免疫印迹分析测定蛋白质浓度,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF, IL-8,采用HIF-1α脉冲标记方法对放射性标记的HIF-1α蛋白质进行SDS-PAGE电泳,使用HydroTech干胶设备(Bio-Rad Laboratories, USA)干胶,然后放射自显影。通过上述方法探讨富马酸二甲酯(DMF)对HIF-1α表达和功能的影响,对HIF-1α及其目标基因表达及影响。结果：在本研究中,我们发现,DMF可以抑制成骨细胞中因缺氧诱导的HIF-1α及其目标基因,如白介素8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)在M℃3T3E1细胞中的表达。DMF以蛋白酶依赖、von Hippel-Lindau (VHL)蛋白不依赖的方式促进HIF-1α的降解。重要的是,我们发现DMF打断HIF-1α和它的分子伴侣热休克蛋白90(Hsp90)之间的相互作用,但可以促进HIF-1α和激活的蛋白酶C (RACK1)受体之间的相互作用。这些数据显示,DMF可能通过影响HIF-1α蛋白的折叠和成熟从而促进其降解。结论：HIF-1α在成骨细胞缺氧中表达明显增高。DMF是一种新型的HIF-1α抑制剂,它可通过改变与伴侣蛋白Hsp90和RACK1的功能性相互作用来抑制成骨细胞中的HIF-1α。我们的研究让人们对DMF在骨折及骨质疏松症成骨细胞缺氧过程中的药理作用有了更深一步的了解。为治疗骨折及骨质疏松症提供了一种新的思路。第二部分富马酸二甲酯对椎间盘髓核中低氧诱导因子-1a分泌及表达的影响研究背景：众多的研究结果证明是椎间盘退变是脊柱退变的始动因素,因此研究椎间盘退变的病理、生理改变是我们解决是脊柱退行性疾病的关键。然而,目前研究多集中于生物力学因素、生理、生化因素、机体免疫、细胞因子、炎症介质等多方面的研究,然而其确切机制发病机制尚无定论。上述各种因素会导致椎间盘内蛋白多糖含量减少、髓核细胞凋亡、新生血管的形成等等,而这些被普遍认为在椎间盘退变过程中发挥着重要作用。HIF-1a是一种使组织细胞适应低氧环境的重要分子,是机体在低氧状态下调剂机体功能的一种重要氧依赖转录激活因子。其可以促进血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖受体及促红细胞生成素(EPO)生成,激活炎症因子的表达,诱导泡沫细胞的形成,调控细胞的凋亡及分化。现已证明,缺氧可以上调几个重要基因的表达,包括可以促进新血管的形成和介导炎症反应的血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-8 (IL-8)。HIF-1α的蛋白质水平通过可控的蛋白质水解作用受到氧张力的严格调控先前的实验研究表明免疫组化的方法证实,HIF-1α的表达在突出椎间盘要明显高于正常椎间盘,表达程度与细胞凋亡之间存在正相关性,髓核内HIF-1a的表达会伴随椎间盘髓核组织破坏程度的增加相应升高。我们根据自己第一部分的研究结果已经证实DMF是一种新型的HIF-1α抑制剂,本实验决定进一步检测新型HIF-1α抑制剂富马酸二甲酯对其在椎间盘退变过程中的影响。因此探讨HIF-1α在退变椎间盘组织内的表达以及富马酸二甲酯对其表达的影响,对于步揭示和完善椎间盘退变的机制,以及对于椎间盘退变的预防和治疗意义重人目的：建立SD大鼠腰椎间盘退变动物模型,在此基础上采用影MRI、组织学验证退变模型的可靠性,免疫组织化学、免疫印迹等实验方法测定HIF-1α在椎间盘髓核中的表达及作用,探讨富马酸二甲酯对其表达及分泌的影响。方法：实验研究对象为SD大鼠,48只大鼠按照设计随机分为三组,正常对照组A组(无任何干预措施)、模型对照组B组(单纯行动物模型处理)、模型实验组富马酸二甲酯组C组(建立模型后口服富马酸二甲酯),每组16只。实验组采用手术方式建立实验模型：麻醉成功后切除L1-L6棘上韧带、棘间韧带及两侧竖棘肌,咬骨钳咬除棘突、关节突,建立腰椎间盘退变的实验动物模型。动物实验模型建立术后2周开始给药,富马酸二甲酯组C组给予50mg/kg/d灌胃给药,持续给药6周,模型对照组B组给予等体积的生理盐水,正常对照组A组未行任何干预措施。于术后8周将全部的SD大鼠麻醉后行腰椎MRI扫描,扫描后使用组织病理、免疫组织化学及免疫印迹等实验方法对椎间盘组织进行检测。结果：通过此种手术方法建立腰椎间盘退变动物模型确实可靠,MRI显示模型对照组及富马酸二甲酯椎间盘退变明显,T2信号减低,差异有统计学意义(P0.05)。组织病理学结果显示模型对照组,外周纤维环出现纤维样变,髓核细胞的数目减少,终板退变。透射电镜下观察结果显示实验组中较对照组髓核细胞数目明显减少,细胞突起减少或消失,糖原颗粒及细胞器数目在细胞内的表达明显减少,胶原原纤维发生变性、融合,甚至钙化。免疫组化显示椎间盘髓核组织中富马酸二甲酯组HIF-1a表达呈阳性,与模型对照组及正常对照组有显著性差异(P0.05)。蛋白印迹检测结果富马酸二甲酯组HIF-1a表达水平较模型对照组低,有显著性差异(P0.05)。结论：HIF-1在退变的腰椎间盘组织中表达增高,其表达与腰椎的退变密切相关。富马酸二甲酯作为HIF-1a的抑制剂能降低HIF-1a的表达,抑制和延缓腰椎间盘退变的形成和发展。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.53

【参考文献】