Kupffer细胞在热射病中的功能变化及丹参酮ⅡA磺酸钠对其调控作用研究

发布时间：2018-03-07 12:27

本文选题：热射病　切入点：大鼠模型　出处：《南方医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景热射病(heat stroke,HS)是一种急性热致疾患,典型表现为核心体温升高(40℃)和神经系统功能障碍,按发病原因不同分为经典型热射病(classical heat stroke, CHS)和劳力型热射病(exertional heat stroke, EHS)。随着全球气候变暖和城市热岛效应加剧,夏季极端气候不断出现,HS的发生率和死亡率明显上升,严重威胁着人民身体健康。其发病机制至今仍未完全阐明,而HS动物模型的建立对此具有重要意义。传统的CHS动物模型建立方法是将大鼠置于仿真热气候动物舱内、模拟高温高湿环境促使其发病。然而仿真热气候动物舱设备价格昂贵、体积庞大,因而限制了其应用。而动物体温维持仪建模时间短、成本低、实验条件要求相对降低,具有广泛应用的潜在价值,但目前尚无两种方法对比的研究。对于其发病机制,国内外学者提出了热直接损伤、肠源性内毒素血症、热调节功能障碍、热应激异常等致病学说。热应激状态下的内毒素血症是近年来研究的热点。该学说认为：当体温升高到一定程度时,肠粘膜对内毒素的通透性增大,肠道内毒素大量进入血液循环,刺激免疫细胞,释放肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)等细胞因子,这些细胞因子与内毒素共同作用,引发炎性级联反应,最终导致HS及其并发症的发生。一些研究也发现,针对内毒素或某些细胞因子的措施可降低HS的发病率或死亡率。这些理论构成了HS内毒素学说的基本骨架,肠源性内毒素血症的形成和炎性反应的爆发在HS的发生发展过程中起着关键的作用,而这两者都可能与肝脏Kupffer细胞(Kupffer cells, KCs)关系密切。KCs是位于肝窦内的巨噬细胞。正常情况下,由肠道吸收入门静脉的内毒素几乎可被KCs全部清除。有研究发现肝脏缺血再灌注、阻塞性黄疸、肝纤维化、失血性休克和胰腺炎时KCs的吞噬功能受到抑制,分泌功能亢进,致使炎症反应扩大,病情加重；抑制KCs的分泌功能则可减轻上述疾病的炎症反应,改善病情。目前,KCs与HS发生发展的关系还不清楚。在HS的致病过程中,既有体温升高的持续打击又有内毒素的不断刺激,KCs处于这种特殊环境之下,其吞噬和分泌功能发生了怎样的变化?这些变化与HS内毒素血症的形成及炎性反应的爆发有何关联?产生这些变化的可能机制是什么?目前国内外尚无相关研究报道。我们推测KCs可能与HS的发生发展存在联系。理由如下：1、分析HS时内毒素血症的形成原因,除了与内毒素的生成增多有关外,不能排除KCs吞噬功能减弱的可能。因此,我们推测,HS时KCs的吞噬功能减弱,利于肠源性内毒素溢出网状内皮系统,激活循环或组织中的的炎性细胞,形成炎症瀑布,造成机体多脏器炎性损害；2、研究已发现HS患者血浆炎症因子TNF-α、IL-1β、INF-γ水平是升高的；将体温降至正常水平并不能抑制这些炎症因子,KCs具有很强的分泌炎性细胞因子的能力。因此,我们推测,HS时KCs吞噬内毒素能力下降、并分泌过多的炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、INF-γ),推动HS的炎症反应过程。丹参具有多种药理作用,其有效成分之一丹参酮ⅡA具有改善血液循环、抗菌和抗炎等作用,由于该成分为脂溶性,难溶于水,临床上多使用其极易溶于水的磺酸钠盐(丹参酮ⅡA磺酸钠,sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)。研究发现STS可抑制KCs分泌活性,减轻炎症反应造成的肝损伤。据此我们推测,HS时STS可以调节KCs的功能,即改善其吞噬功能、抑制其分泌功能。研究目的本研究旨在明确：1.应用动物体温维持仪与仿真热气候动物舱建立的大鼠CHS模型是否相似；2.HS时KCs的功能是否发生改变；3.STS干预能否改善HS时KCs的功能变化。方法一、应用动物体温维持仪与仿真热气候舱建立大鼠经典型热射病模型的比较1.SPF级雄性SD大鼠24只,随机分为3组,每组8只,分别为室温对照(C-C)组、高温对照(HS-C)组、高温麻醉(HS-A)组。实验期间C-C组大鼠置于室温自由活动。HS-C组大鼠预设干球温度(35±0.5)℃、湿球温度(27±0.5)℃的仿真热气候动物舱内进行热暴露。HS-A组大鼠麻醉后置于预设温度为35℃的动物体温维持仪的电热毯内接受热暴露。2.监测大鼠核心体温(Tc,以直肠温度代替)、动脉收缩压(SBP,以尾动脉收缩压代替),直至SBP上升至峰值后开始下降作为大鼠HS发生的标志,记录大鼠发病时间及Tc。3.所有大鼠于建模前一天、建模结束时麻醉后采血,检测外周血白细胞(WBC)计数,ELISA检测血清CRP、TNF-α、IL-1β浓度。4.建模结束时将各组大鼠麻醉后开颅、开腹,观察各组大鼠大脑、肺、肝、小肠、肾等主要脏器大体病变,留取相应标本行HE染色,观察病理改变。二、热射病大鼠模型中Kupffer细胞功能变化及丹参酮ⅡA磺酸钠对其功能的调控作用1.SPF级雄性SD大鼠57只,随机分为4组：正常对照(NC)组3只；热射病模型(HS)组、丹参酮ⅡA磺酸钠干预(STS)组、生理盐水干预(NS)组各18只,三组大鼠按建模结束／给药后Oh、2h、6h、12h、24h、48h依次随机分为6个亚组,每组3只。2.NC组大鼠置于室温自由活动。HS、STS、NS组大鼠在应用动物体温维持仪、以核心体温达到43.5℃为标准建立CHS模型后立即转移至室温环境,STS组大鼠按2mg/100g体重经股静脉给予STS,NS组大鼠经股静脉给予等体积生理盐水,HS组大鼠不予特殊处理。3.在各亚组达相应时间点后分别股静脉注射印度墨水(0.1ml/100g),肝脏组织HE染色计算KCs吞噬指数及门静脉、肝静脉抽血,鲎试剂盒检测内毒素浓度评估KCs吞噬功能；ELISA检测外周血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ浓度,RT-PCR检测肝脏组织炎性因子mRNA表达水平评估KCs分泌功能。统计分析实验数据使用SPSS19.0进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析,多样本均数间的多重比较采用LSD-t检验；计数资料以频数和率表示,组间比较采用x2检验。P0.05为差异有统计学意义。结果一、应用动物体温维持仪与仿真热气候舱建立大鼠经典型热射病模型的比较1.HS-C组与HS-A组大鼠接受热暴露之后呼吸、心率加快,皮肤黏膜出现紫绀,唾液腺分泌增加。HS-C组大鼠逐渐出现精神萎靡。两组大鼠均可见四肢抽搐现象发生。实验结束时,HS-C组大鼠死亡2只,HS-A组死亡1只。2.HS-A组大鼠发病时间比HS-C组明显缩短,发病时SBP及Tc比HS-C组低(P0.01)。3.HS-A组与HS-C组大鼠建模后外周血WBC计数、CRP、TNF-α、IL-1β等炎症相关指标明显升高(P0.01)。建模后HS-A组大鼠CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子水平比HS-C组低(P0.01),而两组大鼠WBC计数无统计学差异。4.建模后HS-A组与HS-C组大鼠主要脏器病理改变无明显差异。二、热射病大鼠模型中Kupffer细胞功能变化及丹参酮ⅡA磺酸钠对其功能的调控作用1.HS大鼠KCs吞噬印度墨水及自身肠源性内毒素的能力与NC组相比明显下降(P0.01),NS组大鼠KCs吞噬能力在各个时间点与HS组相比无明显差异(P0.05),但STS干预可显著提高其吞噬指数、改善其对内毒素的吞噬(P0.05)。2.HS大鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IFNI-γ等炎性因子的水平、肝脏KCs上述炎性因子的mRNA水平较NC组明显升高(P0.01)。NS干预对HS大鼠炎性因子表达无明显影响,而STS干预可显著降低外周血炎因子水平、下调KCs中上述炎性因子mRNA的表达(P0.05)。结论1.应用动物体温维持仪建立大鼠CHS模型与仿真热气候动物舱法无明显差异,并且前者能够明显缩短建模时间、节约成本,是一种简易、可靠而又经济的大鼠CHS模型建立方法,可以代替仿真热气候动物舱法。2.HS时,肝脏KCs吞噬功能下降、分泌功能亢进,而STS能够改善其吞噬功能、抑制其分泌功能,在治疗HS方面具有很好的临床应用前景。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285

【参考文献】