鞘内注射速度对AAV介导的microRNA在ALS模型小鼠中的治疗效果研究

发布时间：2018-03-07 16:43

本文选题：腺相关病毒　切入点：micro　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种致死性的慢性进行性中枢神经系统变性疾病,以选择性侵犯上、下运动神经元为特征,主要累及大脑皮层运动神经元、脑干运动神经核团、脊髓前角运动神经元,临床表现为骨骼肌的进行性萎缩。其中约90%为散发性肌萎缩侧索硬化(sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,s ALS),其余为家族性肌萎缩侧索硬化症(familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,f ALS)。绝大多数患者通常在诊断后3-5年内死亡,目前尚无有效的治疗方法。迄今为止,ALS的病因尚未完全明确。其中,突变的超氧化物歧化酶(mutant Superoxide Dismutase 1,m SOD1)是ALS首个被发现的致病基因,也是f ALS患者中目前发现的主要突变基因(约占20%)。虽然m SOD1确切的致病机制仍处于探索之中,但是针对m SOD1的基因治疗已在不断深入。目前多项研究证明腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)介导的基因疗法可通过敲降m SOD1有效地延长SOD1-G93A小鼠的生存期,这为ALS的治疗提供了新途径。由于高效、广泛的中枢神经系统基因转导是基因治疗的关键,因此,与载体转导和表达密切相关的AAV血清型和注射方式的选择显得尤为重要。为进一步探索micro RNA的治疗效果及更优化的基因传递方法,我们在之前建立的简易、客观、可评估的鞘内(intrathecal,IT)注射的基础上,探究了注射速度对AAV在中枢神经系统(central nervous system,CNS)转导效率的影响,进一步确定了在相对高效、精准的操作下AAV介导的micro RNA对SOD1-G93A小鼠的治疗效果。方法:1鞘内注射及实验分组1.1鞘内注射我们通过直接腰椎穿刺的方法给SOD1-G93A小鼠(30d)鞘内注射8ul含有1%利多卡因盐酸盐的r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1(3×1012GC/ml)和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),且分别采用不同的注射速度:8分钟内注射完毕(8μl/8min)和30秒内注射完毕(8μl/30s)。鞘内(IT)注射的评价标准为:0分-肢体无瘫痪;1分-后肢轻瘫;2分-后肢未完全瘫痪伴明显步态异常或者仅单侧后肢完全瘫痪;3分-双后肢完全瘫痪;4分-双后肢完全瘫痪、呼吸急促伴双上肢轻瘫;5分-四肢完全瘫痪伴呼吸急促。其中,IT注射评分≥4分者视为注射成功。1.2实验分组雌性、雄性SOD1-G93A小鼠(30d),各分为三组:低速注射组(r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1,8μl/8min),快速注射组(r AAVrh.10-GFPami R-SOD1,8μl/30s),对照组(PBS,8μl/8min或8μl/30s)。2行为学观察及体重测量各组SOD1-G93A小鼠从30d即注射后开始,90d前测量体重1次/1周,后2次/周,测量尽量在同一时间段内进行。低速注射组与对照组分别在110d、120d、130d量取后肢步长。严密观察,妥善饲养,记录发病日期与终末日期。因体重的客观性,本实验以体重达峰值后连续两次下降的第二次降低时间为评价发病与否的主要标准,并结合其后肢活动情况。终末的判断标准为:将小鼠侧翻后30s内不能翻身。3组织处理与免疫染色3.1组织处理取各组SOD1-G93A小鼠鞘注后6w、发病早期(约120d)、终末期(135-144d)各3-4只,麻醉后经PBS处理,4%多聚甲醛固定24h后的脑与脊髓组织经30%蔗糖4℃过夜脱水后用OCT包埋组织,使用冰冻切片机切成厚25μm切片;取腰4或腰5脊神经根于0.01M PBS溶液内4℃保存。另外,每组取3-4只发病早期(约120d)小鼠经2.5%戊二醛固定后取腰4或腰5脊神经根于4%戊二醛溶液内4℃保存用于半薄切片、甲苯胺蓝染色。3.2免疫组织化学染色脊髓切片经过1%H2O2处理后于PBS内漂洗,血清封闭(PBS+5%羊血清+0.3%Triton X-100)后,一抗孵育4℃过夜,其中6w和终末期的脊髓片分别加入抗GFP抗体,120d左右的脊髓片孵育抗Neu N、抗GFAP抗Iba1抗体。经PBS漂洗后孵育二抗、三抗后,DAB显色,后经捞片、脱水、透明及封片,Olympus BX51显微镜观察及记录。对于神经元计数,脊髓前角直径大于20um的多突起有核神经元视为运动神经元。3.3免疫荧光染色脊髓切片或整个神经根,经漂洗、穿孔、封闭,选择相应一抗(抗GFP、抗Neu N、抗GFAP、抗Iba1、抗APC和抗h SOD1抗体)孵育过夜后经荧光二抗孵育并再次PBS漂洗后,DAPI封片,使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜进行观察及照相。3.4甲苯胺蓝染色三组脊神经前根(约120d)经磷酸盐缓冲液漂洗后,锇酸固定,丙酮脱水后,树脂包埋,切成厚1μm的半薄切片,贴片,烤干,甲苯胺蓝染色后冲洗,Olympus BX51显微镜观察及记录。对于神经根轴索计数,髓鞘淡染均匀者视为正常轴索,反之视为异常。4蛋白印迹终末期小鼠(140d-147d)经麻醉后,取其皮层、腰髓,液氮速冻后,-80℃保存备用,后提取组织总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为50μg,经SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜,脱脂奶粉封闭后,一抗(抗GFP、抗GAPDH)4℃摇床孵育过夜。次日漂洗后经荧光二抗孵育,再次漂洗后经Odyssey红外扫描成像系统扫膜,分析结果。5统计分析计量资料用x±SEM表示,采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计处理。发病时间和生存期采用Kaplan Meier分析,两组之间的比较用两独立样本t检验,多组之间的比较用One-way ANOVA分析,StudentNewman-Keuls test两两分析。P0.05为有显著差异,有统计学意义。结果:1 r AAVrh.10经鞘内注射后在SOD1-G93A小鼠整个脊髓中持续表达,且较低的注射速度下r AAVrh.10的表达效率更高。2快速鞘内注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1在大脑的转导效率较高。3低速鞘内注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1对在脊髓神经根表达较高且对脊神经前根有更好地保护作用。4低速鞘内注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可使SOD1-G93A小鼠推迟发病并延长生存期。5 r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可转导神经元和神经胶质细胞,并可在体内敲降m SOD1。6低速鞘内注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可缓解SOD1-G93A小鼠腰髓前角的胶质细胞增生并保护运动神经元。结论:鞘内注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可实现在ALS小鼠中枢神经系统的持续广泛转导,且有确切的治疗作用。另外,注射速度影响AAV的转导模式和治疗效果,表明注射时瞬时升高的CSF压力在AAV载体的扩散中发挥着重要作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R744.8;R-332

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