小鼠结肠癌细胞中CD44蛋白表达对肝转移影响的实验动物研究

发布时间：2018-03-08 17:48

本文选题：结肠癌　切入点：Colon26　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：运用细胞培养技术将对数期生长的C26结肠癌细胞通过脾脏注射方法建立BALB/c小鼠结肠癌肝转移的模型，观察结直肠癌肝转移形成的时相及转移程度，并研究不同时期结肠癌肿瘤中CD44蛋白的表达对肝转移的影响，为结肠癌肝转移的机理提供理论基础。方法： 1小鼠结肠癌（C26）细胞的培养：将冻存的C26细胞复苏至含有10%的胎牛血清的DMEM-F12培养基培养，另加浓度为100U/ml的青霉素及链霉素的双抗，培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代。观察细胞的生长状况，获取足量对数生长期生长活跃的实验用结肠癌细胞。 2结肠癌肝转移动物模型的构建方法：将48只小鼠分为对照组（8组）和实验组（40只）。对照组及实验组在同等条件下饲养，对照组不予任何处理；将40只实验小鼠按照下述方法建立模型，小鼠称量后，采用3%戊巴比妥钠，按照50mg/Kg剂量行腹腔注射麻醉，固定小鼠四肢，皮肤消毒后，在小鼠左上腹行约2cm长切口，然后逐层进腹，无菌纱布保护切口，于腹外侧找到柳叶状脾脏后小心将其托出切口外,用1ml注射器5号针头从脾上极平行进针约2mm,注意不要将脾脏穿破防止出血，然后向脾脏被膜下注入细胞浓度为1×106个/ml的单细胞悬液0.1ml，可见注射部位脾脏被膜发白肿胀，拔出针头同时用棉球压迫止血5分钟，仔细观察无出血后，将脾脏回纳入腹腔，逐层关腹。 3实验小鼠的观察：在脾脏注射瘤细胞以后对40只实验小鼠再随机分为4组，每日观察各组小鼠的精神状况及生长情况，于术后第3、6、9、12天分别计算各组小鼠生存率后处死动物，脾脏原发肿瘤及肝脏均送病理检查，观察计算各组实验小鼠的成瘤率及肝脏转移率。 4不同时相动物肿瘤组织CD44蛋白表达的检测：通过免疫组织化学及图像定量分析软件检测处死后的小鼠脾脏原发肿瘤组织CD44蛋白表达情况，推断CD44蛋白的表达差异对肝转移的影响。结果： 1复苏的C26细胞在显微镜下观察发现细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央为卵圆形核，胞质不规则突起，细胞与细胞之间彼此紧密相连，伸展有力，未发现真菌及细菌感染，细胞贴壁生长状态良好。 2实验小鼠脾脏种植肿瘤细胞后，分别在术后第2天及术后第11天各死亡1只，对照组实验小鼠无死亡，因此，本实验术后第3天组、术后第6天组、术后第9天组及术后第12天组中实验小鼠的存活率分别为90%、100%、100%、90%。在术后第3天组中，对第2天死亡小鼠进行解剖，，肉眼下未观察到脾脏及肝脏肿瘤的形成、腹腔亦未见明显出血情况，考虑为实验小鼠个体对麻醉手术耐受程度或机体免疫反应存在明显差异所致；其余小鼠处死后解剖发现脾脏形成大小约0.3至0.5cm大小单发癌结节，镜下观察可见肿瘤细胞成团分布，异型性明显，与脾脏结构分界清楚；肝脏肉眼下观察未见肿瘤形成，但在1只小鼠肝脏组织中镜下观察却发现有微灶转移表现，本组脾脏成瘤率90%，肝脏成瘤率10%。在术后第6天组中，处死小鼠后肉眼观察可见，脾脏肿瘤明显增大，最大肿瘤直径大小约0.8cm,明显突出脾脏表面，呈黄白色，部分实验小鼠肝脏肉眼可观察到多发散在米粒样、针尖样转移瘤，镜下发现脾脏肿瘤细胞无腺管、腺泡结构，呈低分化腺癌表现，镜下肝脏可见大量肿瘤细胞生长，挤压周围肝组织呈萎缩表现，本组脾脏成率100%，肝脏转移率60%。在术后第9天组中，对实验小鼠的解剖肉眼下观察可见脾脏原发肿瘤继续增大，周围出现卫星癌结节病灶，少数肿瘤表面可见溃烂面形成，脾脏肿瘤与腹腔其他器官、腹膜粘连，镜下可见大量肿瘤细胞弥漫性生长，肉眼下观察肝脏表面形成大小不等的转移瘤，临近转移瘤相互融合，镜下大量肿瘤细胞间尚可见部分正常肝组织，呈岛状分布，本组脾脏转移率100%，肝脏转移率100%。在术后第12天组中，第11天死亡小鼠一例，尸体解剖中肉眼下可见脾脏肿瘤与周围组织粘连紧密，肿瘤压迫肠腔，腹腔出现大量腹水，考虑为动物死亡为肿瘤的进展及广泛转移所致，本组实验小鼠种植肿瘤较前明显增大，与腹内其他脏器广泛粘连，肝脏出现大小不等的弥漫性肝脏转移瘤，并且有腹腔内广泛播散的表现，镜下可见脾脏内大部分为肿瘤细胞，超过脾脏正常细胞比例，分化差，未见脉管瘤栓，肝脏镜下表现可见肿瘤分布与脾脏大致相同。本组脾脏转移率100%，肝脏转移率100%。 3运用免疫组化方法及图像定量分析软件检测实验组小鼠脾脏肿瘤细胞中CD44蛋白表达并进行统计学分析：术后第3天组脾脏肿瘤细胞中CD44蛋白表达积分光密度值为（102.77±5.51）；术后第6天组脾脏肿瘤细胞中CD44蛋白表达积分光密度值为（132.84±5.11）；术后第9天组脾脏肿瘤细胞中CD44蛋白表达积分光密度值为（164.65±5.50）；术后第12天组CD44蛋白表达积分光密度值为（167.14±6.12），对各组之间CD44蛋白表达的积分光密度值进行两两比较，除术后第9天组及术后第12天组比较P0.05无明显差异外，其余各组两两比较P0.05,差异具有明显的统计学意义。结论： 1将鼠结肠癌细胞（C26）通过脾脏注射的方法可成功的建立结肠癌肝转移的动物模型，该模型具有成瘤率及转移率高，实验时限短，能较真实模拟结肠癌肝转移实际过程的特点，为结肠癌肝转移的研究提供了有用的实验基础。 2随着小鼠结肠癌细胞的不断增殖，脾脏肿瘤细胞中CD44蛋白的表达的明显增加，肝脏转移程度也相应加剧，推测CD44蛋白的表达升高，能够促进肝脏转移瘤的形成，与结肠癌肝脏转移瘤发展密切相关。 3以小鼠肝转移模型为载体进行进一步研究，逐步阐明结肠癌肝转移的机制及筛选有效干预措施，可为结肠癌肝转移的防治提供理论依据。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.35

【参考文献】