RyR2-PBmice鉴定及RyR2基因转座子插入突变对小鼠心脏和胰脏功能的影响

发布时间：2018-03-11 17:05

本文选题：RyR2　切入点：piggyBac　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：兰尼碱受体(Ryanodine receptors,RyRs)是位于细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)上的钙释放通道,由四个亚基组成,分子量约565 KD。根据编码基因的不同可分为RyR1、RyR2和RyR3三个亚型,其中RyR2主要分布于心脏组织,通过Ca~(2+)诱导的Ca~(2+)释放(Ca~(2+)induced Ca~(2+)release,CICR)机制参与心脏的兴奋收缩偶联。RyR2对心脏维持正常的生理活动至关重要,其功能异常会引起Ca~(2+)调节紊乱而导致心律失常、心力衰竭等多种心脏疾病。转基因动物模型可以为发现和评价人类疾病提供有利的工具,小鼠与人的基因组相似程度高,繁殖周期短,是最常用的模式动物。在小鼠体内通过转基因、基因诱变等改变相关功能基因的序列和结构,可以用来制备人类疾病的动物模型,探索疾病发生的机制,开发疾病相关的治疗药物等。转座子是基因组中一段可移动的DNA序列,可作为一种转基因载体广泛应用于基因功能研究中。piggyBac(PB)转座子是近年来发现的可在小鼠体内高效转座的哺乳动物基因工程工具,具有转座活性高、负载容量大、切除后无痕和长期稳定遗传等多种优势,基于piggyBac转座子的转基因技术已经培育出基因突变的转座鼠(PBmice)。作为体内重要的细胞内Ca~(2+)释放通道,本研究我们将采用复旦大学成功构建的PBmice,探讨PB插入突变对RyR2自身功能以及小鼠体内生物学特性的影响。本课题第一部分,我们首先从复旦大学PB突变信息数据库(PiggyBac Mutagenesis Information Center,http://idm.fudan.edu.cn/PBmice/)中筛选并引进了piggyBac转座RyR2基因杂合小鼠(RyR2-PBmice)。转座子插入突变小鼠表现为纯合子宫内死亡而杂合子生长状态良好,说明PB转座子的插入可以引起RyR2基因功能丢失或异常,同时也反映了RyR2基因功能对小鼠生命过程维持的重要性。通过转座元件携带的红色荧光蛋白(Red Fluoresent Protein,RFP)追踪和PCR测定,我们成功鉴定了RyR2-PBmice。通过对小鼠的生长状态分析,发现该RyR2-PBmice可稳定遗传,其外观表型与野生型小鼠(WTmice)并无明显差别。由于PB转座元件中带有RFP的融合序列,因此我们采用激光扫描共聚焦显微镜一方面检测RFP分布,同时利用免疫荧光技术监测RyR2在体内的分布情况。研究发现RyR2主要表达于心脏、骨骼肌、平滑肌和脑组织中,RFP与RyR2的表达分布基本一致。与WTmice相比,RyR2-PBmice中RyR2的表达水平未见明显的差异。为进一步验证转座后RyR2的表达变化,我们对RyR2-PBmice和WTmice心脏组织进行了RT-PCR和Western Blot实验分别从mRNA和蛋白水平进行了研究。结果发现RyR2-PBmice心脏组织中RyR2的mRNA水平比WTmice显著降低,但Western Blot研究表明RyR2的表达量与野生小鼠相比未见显著性差异。说明RyR2-PBmice通过转录后修饰维持了与WTmice相当的RyR2表达水平,这可能是RyR2-PBmice可以维持正常心脏兴奋收缩偶联以及正常生长状态的重要原因。RYR2作为心肌细胞内肌浆网Ca~(2+)释放通道,是维系心肌细胞ca2+稳态与心脏正常兴奋收缩偶联过程,以及心脏正常收缩与舒张功能的关键蛋白。因此,在本课题的第二部分研究中,我们首先研究了piggybac转座插入ryr2基因对ryr2-pbmice心脏结构与功能的影响。异氟醚麻醉下监测ryr2-pbmice和wtmice心电图发现在基础状态和注射肾上腺素和咖啡因状态下,两组小鼠的心电图没有明显差异,说明ryr2-pbmice并不会影响到小鼠在基础和应激状态下的心脏功能。进一步通过激光扫描共聚焦显微镜测定咖啡因刺激后小鼠心肌细胞的肌浆网ca2+容量,发现ryr2-pbmice心肌细胞肌浆网ca2+容量明显减小,这提示ryr2-pbmice对心肌细胞ca2+稳态仍然存在一定的影响。组织病理学和透射电镜观察发现ryr2-pbmice心肌组织内线粒体嵴大量断裂、溶解,并且线粒体膜结构不完整。线粒体功能研究则发现ryr2-pbmice心肌线粒体膜电位下降,atp含量明显降低。这些结果提示piggybac转座插入ryr2基因严重影响了小鼠心肌线粒体的结构和功能,导致能量代谢障碍。为进一步分析piggybac转座插入ryr2基因对小鼠心脏,尤其是心脏线粒体结构和功能影响的作用机制,我们对比研究了ryr2-pbmice和wtmice两组小鼠心脏组织的转录组学并筛选出部分与ryr2以及线粒体功能密切相关的信号通路差异蛋白,并利用rt-pcr和westernblot进行了进一步的验证。结果发现,通过调节pka激活ryr2的小g蛋白,线粒体编码的细胞色素c氧化酶,线粒体呼吸链相关的解耦联蛋白ucp以及线粒体钙摄取蛋白均出现明显下调,进一步说明了piggybac转座插入ryr2基因对小鼠心脏ryr2功能以及心肌细胞线粒体的结构功能具有显著的影响。引人注意的是,我们在RYR2-PBmice活检时发现其胰脏组织呈现比其他所有脏器都要明显的粉红色,并且与周围组织的界限非常明显。结合ryr2在胰岛素分泌和葡萄糖体内平衡方面发挥重要作用的文献报道,我们在第三部分针对ryr2-pbmice胰脏结构与功能的影响进行了专门研究。我们认为,ryr2-pbmice胰脏红色颗粒物沉着可能是piggybac转座子携带的红色荧光蛋白富集所致。透射电镜观察结果显示,胰脏中线粒体结构发生异常改变,与心肌线粒体结构变化类似。胰脏功能研究方面,我们对比进行了ryr2-pbmice和wtmice的葡萄糖耐受实验。结果发现基础条件下两组小鼠血清葡萄糖浓度和胰岛素水平接近;当葡萄糖刺激后,ryr2-pbmice葡萄糖和胰岛素浓度与wtmice相比均出现显著性差异,说明ryr2-pbmice的胰岛耐受能力受到明显损害。免疫印迹结果表明ryr2-pbmice胰脏组织中线粒体呼吸功能相关蛋白如细胞色素c氧化酶、解耦联蛋白ucp表达量显著下降,而直接参与葡萄糖转运的葡萄糖转运蛋白glut-4与wtmice中表达量接近。提示piggybac转座插入ryr2基因不直接影响胰脏组织的葡萄糖转运,而是通过影响线粒体呼吸链导致能量代谢障碍,从而影响胰脏组织的胰岛素分泌和体内葡萄糖代谢调节的过程。总之,通过携带有RFP的piggyBac转座子插入RyR2基因成功建立了杂合小鼠RyR2-PBmice的动物模型。虽然没有发现RyR2-PBmice存在心脏功能异常表现,但仍然发现其心肌细胞肌浆网Ca~(2+)容量下降,线粒体结构异常,线粒体呼吸链相关蛋白表达明显下调,说明piggyBac转座插入RyR2基因破坏了小鼠的线粒体能量代谢过程。胰腺组织发现大量的RFP沉积,并且RyR2-PBmice的胰岛素分泌和血糖调节耐受能力下降。与心脏结构与功能研究类似,RyR2-PBmice胰腺组织的线粒体呼吸链相关蛋白同样表达量下降,推测piggyBac转座插入RyR2基因可能通过影响线粒体能量代谢导致了胰岛素分泌功能的下降。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R3416

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