皮下免疫热休克蛋白65对ApoE基因缺失小鼠高密度脂蛋白功能的影响

发布时间：2018-03-13 19:30

本文选题：热休克蛋白65　切入点：ApoE基因缺失小鼠　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致冠心病或脑卒中的主要原因之一,其主要是以血管内皮细胞损伤、血脂代谢异常为基础、以血管慢性炎症免疫反应为特征。既往流行病学研究和动物实验表明,血浆高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平与动脉粥样硬化及冠心病风险呈高度负相关关系,血清HDL-C水平是预测心血管事件发生率的重要指标。HDL是一种脂质和蛋白含量大致均等的异质性脂蛋白,具有重要的保护心血管病的功能,主要包括促进逆胆固醇转运(reverse cholesterol transport, RCT)、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、增强内皮功能、改善糖尿病的血糖控制情况以及抑制造血干细胞增殖等,其中HDL的促RCT和抗炎抗氧化功能尤为重要。然而最近有大量研究证实,HDL-C水平高低并不能准确代表HDL的整体功能,HDL-C水平检测作为HDL功能的度量标准以及预测冠心病发病风险的生物指标存在明显的局限性。在多种因素所致的慢性炎症及急性期反应的状态下,HDL的结构和成分会发生修饰及改变,其原有的正常功能会发生缺失,甚至表现出与其正常功能相反的作用,主要表现为抗炎抗氧化等功能下降,甚至转变为促炎、促氧化和抑制RCT等促AS的作用。因此,研究HDL功能的改变对预测AS及冠心病风险更为重要。 HDL的抗氧化功能主要与它结合的屏氧酶1(paraoxonasel, PON1)有关,临床研究表明,PON1活性低的人群患AS的概率高于PON1活性高的人群。另外,髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)作为一种由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞分泌的白细胞酶,亦与HDL抗氧化功能相关。MPO及其氧化产物可氧化修饰载脂蛋白A-I (apoA-I),从而改变HDL功能。因此通过检测PON1活性及MPO活性可较好的反映HDL的抗氧化功能。巨噬细胞的胆固醇流出是RCT的第一步也是关键步骤,2011年Khera等的研究表明HDL介导的促RCT功能可独立于HDL-C水平更好地预测AS及冠心病发生风险[6]。由此可知,检测胆固醇流出率、PON1活性及MPO活性对全面评估HDL的功能改变及AS的发生发展有重要意义。研究表明,炎症和免疫反应在AS各个阶段起重要作用,热休克蛋白65(heat shock protein65, HSP65)作为分枝杆菌主要抗原之一,具有很强的免疫原性,而且在感染机体时高度表达,并被免疫系统识别,在AS形成中具有重要作用。大量研究证明,免疫HSP65的小鼠其AS的损害及斑块面积明显增大,斑块内促炎细胞因子含量增加,表明HSP65可通过炎症免疫反应,促进AS的发生发展。亦有研究表明炎症刺激可引起HDL功能发生改变,但目前国内外关于HSP65对HDL功能的影响研究较少,皮下免疫HSP65引起炎症免疫反应的同时是否会影响HDL的促胆固醇逆转运及抗炎抗氧化功能尚不明确。因此,我们通过皮下免疫HSP65,观察不同剂量HSP65对载脂蛋白E基因缺失(apolipoprotein E gene knocked-out,ApoE-/-)小鼠HDL促胆固醇逆转运及抗炎抗氧化功能相关的巨噬细胞胆固醇流出率、炎症指数、血清PON1活性、MPO活性等的影响,以进一步探讨HSP65和HDL功能改变之间的关系及其可能的机制。二、研究目的本研究采用高脂饮食喂养ApoE基因缺失小鼠构建动脉粥样硬化模型,观察不同剂量HSP65对HDL抗炎抗氧化功能及巨噬细胞胆固醇流出率的影响,并进一步探索HSP65影响巨噬细胞胆固醇流出率的可能机制。三、研究方法 1、动物分组及干预 8只8周龄C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养作为正常组,24只8周龄ApoE-/-随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、5μg HSP65组及25μg HSP65组,每组8只小鼠。ApoE-/-小鼠分别予以高脂饲料喂养,并在第3周和第6周分别于小鼠背部皮下注射PBS、5μgHSP65或25μg HSP65。第16周进行实验。 2、血脂检测实验的第16周,小鼠空腹12h状态下,乙醚麻醉后心脏采血,3000r/min离心10min取血清,置于-70℃冰箱保存备用。采用酶法在全自动生化仪上测定血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)含量。 3、血清HSP65抗体及白介素-10和干扰素-γ含量测定小鼠血清HSP65抗体采用酶联免疫分析法(ELISA)法测定。血清白介素-10(IL-10)和干扰素-γ (IFN-γ)含量严格根据美国Assay公司提供的试剂盒说明书采用ELISA法检测。 4、HDL抗炎抗氧化功能和外周腹腔巨噬细胞胆固醇流出率检测收集实验第16周的血清标本,采用乙酸苯酯法测定屏氧酶1(PON1)活性；采用MPO试剂盒在分光光度计上测定髓过氧化物酶(MPO)活性；采用非细胞学法测定高密度脂蛋白炎症指数(high density lipoprotein inflammatory index, HⅡ;利用液闪计数仪检测巨噬细胞[3H]胆固醇流出率。 5、肝组织SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-a mRNA表达水平检测肝组织总RNA的提取采用Trizol提取法,实时荧光定量PCR (RT-PCR)进行相对定量检测肝脏SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α mRNA的表达量。 6、肝组织和腹腔巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α蛋白表达水平检测用RIPA裂解液裂解小鼠肝组织和提取的腹腔巨噬细胞,BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白质定量,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定肝脏和腹腔巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ及LXR-α蛋白的表达量。 7、病理组织学观察主动脉斑块形成情况实验第16周心脏采血后,分离小鼠整条主动脉,10%中性甲醛固定液固定,常规制组织石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察其组织病理改变,应用Image-plus6.0专业图像分析软件分析主动脉斑块面积。 8、统计学处理所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS13.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验分析,多组间总体均数比较,在方差齐时采用单向方差分析(one-way ANO VA),方差不齐时采用Welch校正检验。多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett's T3检验,P0.05为差异有统计学意义。四、研究结果 1.各组小鼠血脂水平的比较与正常组相比,PBS组、5μgHSP65组和25μgHSP65组血清TC、TG、LDL-C水平均明显升高(P0.05),HDL-C水平降低(P0.05),差异有统计学意义；PBS组、5μgHSP65组和25μgHSP65组之间TC、TG、LDL-C水平比较,无明显差异,差异无统计学意义(P0.05)；25μgHSP65组与PBS组比较,HDL-C水平明显降低(P0.05)。 2.各组小鼠血清HSP65抗体及炎症因子的比较 PBS组与正常组相比,血清抗HSP65抗体滴度无明显差异(0.22±0.05vs0.19±0.03,P0.05)；与PBS组相比,5μgHSP65组小鼠血清HSP65抗体水平(0.55±0.15vs0.22±0.05,P0.05)升高,差异有统计学意义；与5μgHSP65组相比,25μgHSP65组小鼠血清HSP65抗体水平(1.08±0.24vs0.55±0.15,P0.05)显著升高,差异有统计学意义。 PBS组与正常组相比,血清IL-10含量无明显差异[(338.54±45.16)ng/L vs (350.98±56.87)ng/L, P0.05];5μgHSP65组和PBS组相比,血清IL-10水平为[(303.55±42.47)ng/L vs (338.54±45.16)ng/L, P=0.15],差异无统计学意义；25μgHSP65组和PBS组相比,血清IL-10水平[(253.76±45.06)ng/L vs (338.54±45.16)ng/L, P0.05]显著降低,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比[(253.76±45.06)ng/L vs (303.55±42.47)ng/L, P=0.04],血清IL-10水平显著降低,差异有统计学意义。 PBS组与正常组相比,血清IFN-y含量无明显差异[(121.01±21.48)ng/L vs (116.91±18.06)ng/L, P0.05];5μgHSP65组和PBS组相比,血清IFN-y水平[(139.34±11.43)ng/L vs (121.01±21.48)ng/L, P=0.04]升高,差异有统计学意义；25μgHSP65组和PBS相比,血清IFN-y水平[(185.06±13.80)ng/L vs (121.01±21.48)ng/L, P0.05]显著升高,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比[(185.06±13.80)ng/L vs (139.34±11.43)ng/L, P0.05],血清IFN-y水平显著升高,差异有统计学意义。 3.各组小鼠巨噬细胞胆固醇流出率及HDL抗炎抗氧化功能的比较 PBS组巨噬细胞胆固醇流出率明显低于正常组[(17.98±1.67)%vs(21.83±1.54)%,P0.05],差异有统计学意义；5μgHSP65组和PBS组相比,胆固醇流出率[(15.17±1.14)%vs(17.98±1.67)%,P0.05]降低,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比,胆固醇流出率[(12.52±0.69)%vs(15.17±1.14)%,P0.05]显著降低,差异有统计学意义。 PBS组HDL炎症指数较正常组升高[(1.03±0.10)vs(0.66±0.11),P0.05],差异有统计学意义；5μgHSP65组和PBS组相比,血清HDL炎症指数[(1.21±0.09)vs(1.03±0.10),P0.05]升高,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比,HDL炎症指数[(1.34±0.11)vs(1.21±0.09),P=0.04]显著升高,差异有统计学意义。与正常组比较,PBS组PON1活性下降[(66.32±10.80)U/mL vs (80.75±14.52)U/mL, P=0.02],差异有统计学意义；5μgHSP65组和PBS组相比,血清PON1活性为[(55.40±6.68)U/mL vs (66.32±10.80)U/mL, P0.05],差异无统计学意义;25μgHSP65组和PBS组相比,血清PON1活性[(49.90±10.30)U/mL vs (66.32±10.80)U/mL, P0.05]显著降低,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比[(49.90±10.30)U/mL vs (55.40±6.68)U/mL, P0.05],血清PON1活性差异无统计学意义。 PBS组MPO活性较正常组升高[(37.98±2.88)U/L vs(31.47±2.78)U/LP0.05],差异有统计学意义；5μgHSP65组和PBS组相比,血清MPO活性为[(40.68±3.60)U/L vs (37.98±2.88)U/L, P0.05],差异无统计学意义；25μgHSP65组和PBS组相比,血清MPO活性[(53.10±5.10)U/L vs (37.98±2.88)U/L, P0.05]显著升高,差异有统计学意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比[(53.10±5.10)U/L vs (40.68±3.60)U/L, P0.05],血清MPO活性差异有统计学意义。 4.各组肝组织SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA相对表达量与正常组比较,PBS组SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；与PBS组比较,5μgHSP65组SR-B1ABCG1和PPAR-γ mRNA表达量均明显降低(P0.05),差异有统计学意义；而5μgHSP65组ABCA1和LXR-α mRNA表达量与PBS组相比较无明显差异(P0.05),差异无统计意义；与PBS组比较,25μgHSP65组SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-a mRNA表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；与5μgHSP65组比较,25μgHSP65组ABCG1, PPAR-γ和LXR-α mRNA表达量明显降低(P0.05),差异有统计意义。 5.各组肝组织SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-y和LXR-a蛋白表达情况与正常组比较,PBS组肝组织SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；与PBS组相比,5μgHSP65组肝组织SR-B1, ABCA1和ABCG1蛋白表达量明显减少(P0.05),差异均有统计意义；而5μgHSP65组PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量与PBS组相比较无明显差异(P0.05),差异无统计意义；与PBS组比较,25μgHSP65组SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比,SR-B1, ABCA1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量明显减少(P0.05),差异均有统计意义。 6.各组巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达情况与正常组比较,PBS组巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；与PBS组相比,5μgHSP65组巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1和PPAR-γ蛋白表达量明显减少(P0.05),差异均有统计意义；而5μgHSP65组巨噬细胞LXR-α蛋白表达量与PBS组相比较无明显差异(P0.05),差异无统计意义；与PBS组比较,25μgHSP65组SR-B1,ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义；25μgHSP65组和5μgHSP65组相比,ABCA1, ABCG1和LXR-α蛋白表达量明显减少(P0.05),差异均有统计意义。 7.各组小鼠主动脉粥样斑块面积的比较与正常组相比,PBS组、5μgHSP65组和25μgHSP65组斑块明显,血管腔缩小；与PBS组相比,5μgHSP65组小鼠的斑块面积[(221636.3±86751.70)μm2vs (88918.88±46369.33)μm2, P0.01)明显增多,差异有统计意义；与5μgHSP65组相比,25μgHSP65组小鼠的斑块面积[(385120.6±97695.11)μm2vs (221636.3±86751.70)μm2,P0.01]明显增多,差异有统计意义。五、结论 1.HSP65可诱导炎症免疫反应,升高促炎因子IFN-γ浓度,降低抑炎因子IL-10浓度,使辅助性T细胞(Thl和Th2)功能失衡,在AS的发生发展中有重要作用。 2.HSP65诱导炎症免疫反应的同时损害了HDL的功能,可降低巨噬细胞胆固醇流出率,升高HDL炎症指数和MPO活性,降低PON1活性,且随着HSP65剂量的增加,对HDL功能的影响愈加明显。 3.HSP65可通过下调肝脏和巨噬细胞SR-B1, ABCA1, ABCG1, PPAR-γ和LXR-α的表达而降低巨噬细胞的胆固醇流出率,进一步加速AS的发生发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5

【参考文献】