大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌microRNA表达差异以及正常大鼠肱二头肌与前肢爪内肌神经肌肉接头出生后发育

发布时间：2018-03-15 13:07

本文选题：神经肌肉接头　切入点：出生后发育　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌microRNA表达谱目的检测大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌microRNA表达谱,比较失神经肱二头肌与失神经前肢爪内肌差异表达nicroRNAs。方法7天龄SD幼鼠24只,体重13.3±1.5g,将右前肢全臂丛根性撕脱,以模拟分娩性臂丛损伤所导致的肱二头肌与前肢爪内肌失神经肌萎缩。根据术后1、5、10、15周,随机分为4组,每组6只。在相应时间点,麻醉后应用4%多聚甲醛灌注固定,取出全臂丛撕脱侧和正常侧(左侧)肱二头肌与前肢爪内肌,行Masson染色。观察骨骼肌萎缩与胶原纤维增生,以此为根据选定microRNA表达谱检测时间点。另取7天龄SD幼鼠9只,将右前肢全臂丛根性撕脱,于术后5周,麻醉后取出全臂丛撕脱侧和正常侧(左侧)肱二头肌和前肢爪内肌,应用microRNA微阵列基因芯片检测其microRNA表达谱,将正常肱二头肌与失神经肱二头肌microRNA微阵列基因芯片结果相对照,正常前肢爪内肌与失神经前肢爪内肌microRNA微阵列基因芯片结果相对照,分别获得失神经肱二头肌差异表达microRNAs和失神经前肢爪内肌差异表达microRNAs。应用荧光定量PCR对mcroiRNA微阵列基因芯片检测出的6个差异表达microRNAs进行验证。结果在模拟分娩性臂丛损伤后5周时,失神经肱二头肌与失神经前肢爪内肌的肌纤维横截面积维持率分别为52.3±18.5%和46.6±11.3,肌纤维横截面积显著减少。在10周时,失神经肱二头肌和前肢爪内肌中胶原纤维/总面积分别为44.7±9.9%和71.6士7.2%,纤维结缔组织增生显著。模拟分娩性臂丛损伤后5周时,正常肱二头肌与失神经肱二头肌microRNA微阵列基因芯片结果相对照,筛选出62个差异microRNAs,表达上调36个,表达下调26个；正常前肢爪内肌与失神经前肢爪内肌microRNA微阵列基因芯片结果相对照,筛选出41个差异microRNAs,表达上调30个,表达下调11个。进一步荧光定量PCR验证结果显示,模拟分娩性臂丛损伤后5周时,与正常肱二头肌相比,失神经肱二头肌中miR-322-5p(1.6±0.3 vs 5.2±0.8, t=5.72, P0.05)、miR-495(1.3±0.2 vs 2.7±0.3,t=3.41, P0.05)表达下调,miR-221-3p(2.7±0.3 vs 1.1±0.3,t=2.63,P0.05)表达上调；与正常前肢爪内肌相比,失神经前肢爪内肌中miR-466b-1-3p(7.9±1.5 vs 1.4±0.3,t=5.83,P0.05)、miR-466b-2-3p(7.0±0.9 vs 1.2±0.4, t=3.93, P0.05)表达上调, miR-30a-5p(1.2±0.3 vs 3.3±0.6,t=2.92,P0.05)表达下调,以上结果均与相应 microRNA微阵列基因芯片结果相符合。结论在分娩性臂丛损伤5周的大鼠模型中,失神经肱二头肌和失神经前肢爪内肌有1nicroRNA异常表达,且两者之间差异显著。揭示两种肌肉差异表达microRNAs调节的靶基因所产生的作用,将有助于寻找造成两种肌肉不可逆萎缩进程差异的关键结构与关键蛋白。第二部分大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌差异表达microRNAs靶基因及其生物信息学分析目的对大鼠分娩性臂丛损伤模型肱二头肌与前肢爪内肌差异表达的microRNAs,进行靶基因预测并对其进行生物信息学分析。方法根据上一步microRNA微阵列基因芯片检测结果,取模拟分娩性臂丛损伤后5周时失神经肱二头肌与正常肱二头肌之间以及失神经前肢爪内肌与正常前肢爪内肌之间的差异表达microRNAs,基于miRanda数据库和Mirdb数据库,进行靶基因预测,取两者交集得到差异表达nicroRNAs调控靶基因。根据Gene Ontology数据库,对差异表达microRNAs调控靶基因进行功能显著性分析；根据KEGG数据库,对差异表达microRNAs调控靶基因进行信号传导通路分析。取显著性功能所属基因和生物信号传导通路所属基因交集,分别构建出调控失神经前肢爪内肌和失神经肱二头肌相关microRNAs和基因的调控网络。应用免疫荧光方法,对模拟分娩性臂丛损伤后5周时,肱二头肌与前肢爪内肌运动终板进行形态观察。结果模拟分娩性臂丛损伤后5周时,通过miRanda和Mirdb进行联合预测,失神经肱二头肌差异表达microRNAs中分别得到靶基因数量为9538个和5249个,二者交集靶基因数量为2204个；失神经前肢爪内肌差异表达microRNAs中分别得到靶基因数量为6979个和4073个,二者交集靶基因数量为1143个。在模拟分娩性臂丛损伤后5周时失神经肱二头肌差异表达microRNAs调控靶基因中,上调靶基因显著性功能在数据库中富集程度(Enrichment)≥10的基因数目为33个,下调靶基因显著性功能在数据库中富集程度(Enrichment)≥10的基因数目为18个；有48条生物信号传导通路受上调nicroRNAs 调控,有42条生物信号传导通路受下调microRNAs调控。在模拟分娩性臂丛损伤后5周时失神经前肢爪内肌差异表达microRNAs调控的靶基因中,上调靶基因显著性功能在数据库中富集程度(Enrichment)≥10的基因数目为36个,下调的靶基因显著性功能在数据库中的富集程度(Enrichment)≥10的基因数目为42个；有17条生物信号传导通路受上调microRNAs调控,有21条生物信号传导通路受下调microRNAs调控。模拟分娩性臂丛损伤后5周时,失神经前肢爪内肌与失神经肱二头肌相比终板各参数减少显著：整体终板周长减少程度,54.2±5.1% VS40.0±4.2%(t=2.97,P0.05)。染色区域终板周长减少程度,59.0±6.7% VS49.9±3.5%(t=2.87,P0.05)。整体终板面积减少程度,77.9±8.3% VS 52.6±6.3%(t=3.23,P0.05)。染色区域终板面积减少程度,82.1±6.0% VS 58.1±6.2%(t=3.11,P0.05)。终板的离散程度减少程度,19.6±5.0% VS 16.7±4.8%(t=2.98,P0.05)。标准化终板面积减少程度,46.4±5.4% VS 16.7±7.0%(t=4.98,P0.05)。结论在分娩性臂丛损伤5周大鼠模型中,失神经肱二头肌与前肢爪内肌差异表达microRNAs的靶基因、其显著性功能以及信号传导通路之间存在较大差异。有较多的与神经肌肉接头相关的显著性功能与信号传导通路参与其中,且在上述两种失神经肌肉之间有较大差异。免疫荧光发现,失神经前肢爪内肌内运动终板退变程度更为严重。这些结果提示,失神经后神经肌肉接头的不可逆退变是造成手内肌功能难以修复的重要原因之一。揭示这两种肌肉在神经肌肉接头组织结构和发育进程上差异,将有助于解释产瘫患儿手内肌较肱二头肌更早进入不可逆萎缩的临床现象。第三部分正常大鼠肱二头肌与前肢爪内肌神经肌肉接头出生后发育差异目的寻找大鼠肱二头肌与前肢爪内肌神经肌肉接头在出生后发育过程中形态与烟碱样乙酰胆碱受体亚基构成上的差异。方法7天龄SD幼鼠12只,体重14.1±1.4g,10月龄成年SD大鼠12只,体重217.8±22.8,麻醉后,于体视显微镜下,将右侧肱二头肌与前肢爪内肌取出,其中幼鼠与成年鼠各6只,通过免疫荧光技术,分别对终板,突触囊泡,运动神经末梢和终末雪旺细胞实施特异性染色,在共聚焦显微镜下观察神经肌肉接头形态。应用ImageJ软件对形态图形进行测量。透射电镜观察余下6只幼鼠和6只成年大鼠右侧肱二头肌与前肢爪内肌神经肌肉接头超微结构。另取新生SD大鼠36只,分别于出生后3天、7天、14天、21天、28天、35天,各随机选取6只,取其双侧前肢爪内肌与肱二头肌,应用荧光定量PCR动态检测烟碱样乙酰胆碱受体中胚胎亚基—Y亚基和成熟亚基—ε亚基mRNA的表达水平。另取6只成年大鼠作为成年表达水平对照。结果在突触囊泡形态方面,出生后7天大鼠肱二头肌与10月龄大鼠肱二头肌在整体囊泡区域周长(39.3±3.2 VS 135.2±6.1,t=3.78,P0.05)、染色囊泡区域周长(61.2±5.75VS 282.1±18.5,t=4.12,P0.05)、整体囊泡区域面积(77.2±7.2 VS416.4±29.1,t=5.13,P0.05)、染色囊泡区域面积(35.8±3.3 VS 185.0±15.1,t=5.41,P0.05)4个参数中,两者之间具有显著性差异(P0.05),在囊泡离散程度(46.5±6.1VS 44.4±6.0,t=1.12,P0.05)两者之间无显著性差异；在10月龄前肢爪内肌与7日龄前肢爪内肌中上述5个参数均有显著性差异(P0.05),整体囊泡区域周长(45.2±3.2 VS 198.2±8.7,t=3.90,P0.05)、染色囊泡区域周长(50.2±4.0 VS370.6±33.8,t=3.19,P0.05)、整体囊泡区域面积(85.8±5.1 VS 777.0±29.9,t=5.09,P0.05)、染色囊泡区域面积(68.4±3.6 VS 543.0±24.2,t=5.24,P0.05)、囊泡离散程度(79.7±8.5 VS 54.1±9.5,t=5.35,P0.05)。在运动神经末梢方面,出生后7天大鼠肱二头肌与10月龄大鼠肱二头肌在神经末梢分支全长(18.7±3.5 VS96.5±11.0,t=4.21,P0.05)、神经末梢分支平均长度(2.7±0.8 VS 12.5±3.5,t=3.91,P0.05)、神经末梢分支复杂度(1.5±0.5 VS 7.8±2.5,t=3.22,P0.05)这3个参数中,两者之间具有显著性差异；而神经末梢分支数量(8.1±1.5 VS 7.2±1.2,t=1.02,P0.05),整体囊泡区域面积/神经末梢分支全长(4.1±0.6 VS 4.3±0.3,t=1.28,P0.05)在10月龄肱二头肌与7日龄肱二头肌之间未见显著性差异。在10月龄前肢爪内肌与7日龄前肢爪内肌中上述5个神经末梢相关测量参数均具有显著性差异(P0.05),神经末梢分支全长(32.3±5.6 VS142.5±21.3,t=4.22,P0.05)、神经末梢分支平均长度(2.5±1.3 VS 13.7±3.6,t=3.27,P0.05)、神经末梢分支复杂度(4.7±1.2VS 16.2±3.5,t=4.46,P0.05)、神经末梢分支数量(4.6±3.8 VS 11.3±2.5,t=2.98,P0.05),整体囊泡区域面积/神经末梢分支全长(2.7±0.5 VS 5.5±0.9,t=2.78,P0.05)。在终末雪旺细胞数量方面,成年大鼠肱二头肌(2.2±0.6)与7日龄肱二头肌(4.1±0.7)中可见显著性差异(t=3.99,P0.05)；10月龄前肢爪内肌(5.3±0.5)与7日龄前肢爪内肌(1.6±0.8)中亦可见显著性差异(t=3.48,P0.05)。在终板形态方面,出生后7天大鼠肱二头肌与10月龄大鼠肱二头肌,在整体终板周长(48.7±4.3 VS 115.1±5.3,t=3.12,P0.05),染色区域终板周长(78.3±6.5 VS181.1±7.2,t=3.45,P0.05),整体终板面积(90.7±6.3 VS 454.1±11.7,t=2.34,P0.05),染色区域终板面积(50.2±4.3 VS 250.4±9.5,t=5.31,P0.05)方面两者之间具有显著性差异。而在终板离散程度(54.8±4.8 VS 55.1±6.1,t=-0.72,P0.05)与标准化终板面积(7.3±0.5 VS 7.7±0.5,1.21,P0.05)方面无明显差异；出生后7天大鼠前肢爪内肌与10月龄大鼠前肢爪内肌相比,在整体终板周长(46.0±2.4 VS135.2±5.1,t=2.98,P0.05),染色区域终板周长(55.1+3.5 VS 320.2±10.9,t=3.21,P0.05),整体终板面积(101.1±9.6 VS 796.4±15.1,t=3.47,P0.05),染色区域终板面积78.2±5.1 VS 616.2±13.2,t=2.98,P0.05),以及终板离散程度(77.4±6.1 VS64.1±8.0,t=3.24,P0.05)与标准化终板面积(10.6±1.8 VS 22.8+1.3,t=3.78,P0.05)方面均有显著性差异。透射电镜观察发现,在出生后7天大鼠前肢爪内肌神经肌肉接头,终末雪旺细胞体积较大,神经末梢约2/3被其包裹,神经末梢数量较多,但直径较小,内含突触囊泡较少,仅发现有初级突触裂隙,次级突触裂隙正在形成中。在出生后7天大鼠肱二头肌神经肌肉接头中,终末雪旺细胞体积较大,神经末梢较大面积被其包裹,其内含有多个神经末梢,但直径稍大,内含突触囊泡较多,可见初级突触裂隙与较为浅表的次级突触裂隙。在大鼠肱二头肌中,出生后3天(1.3±0.7),7天(1.7±0.2),14天(2.4±0.4)￡亚基mRNA表达量逐渐上升,出生后21天(1.8±0.4),28天(1.3±0.2)ε亚基mRNA表达量逐渐下降,35天(1.3±0.2)达到成年￡亚基mRNA表达量水平(1.3±0.3)；出生后3天(1.0±0.1),7天(0.9±0.2),14天(0.3±0.1)均检测到γ亚基mRNA表达量,呈缓慢下降趋势,21天之后未检测到γ亚基mRNA表达。在大鼠前肢爪内肌中,出生后3天时未检测到ε亚基mRNA表达量,出生后7天(0.8±0.2),14天(1.5±0.5),21(2.9±0.9)天可检测到￡亚基mRNA,表达量逐渐上升；28天时(1.8±0.3)￡亚基mRNA表达量有所回落,35天时(1.2±0.3)达到成年￡亚基mRNA表达量水平(1.3±0.2)；出生后3天(5.0±0.8),7天(4.3±0.5),14天(4.0±0.6),21天(1.4±0.5),28天(0.6±0.2)时均检测到γ亚基mRNA表达量,呈缓慢下降趋势,到出生后35天时与成年水平一致,均未能检测到γ亚基mRNA表达量。结论在大鼠中,前肢爪内肌神经肌肉接头出生后结构发育进程显著延迟于肱二头肌。其原因可能在于,相对于肱二头肌而言,前肢爪内肌出生后运动功能发育具有延迟性。前肢爪内肌神经肌肉接头的这种出生后发育特点,可能导致其在失神经条件下,较肱二头肌的神经肌肉接头更具有易损性。这些结果为寻找导致上述两种肌肉失神经萎缩进程差异的关键因子提供重要线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.3;R-332

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