2型糖尿病（消渴）从“脾”论治理论探讨与实验研究

发布时间：2018-03-18 00:00

本文选题：运脾津　切入点：津力达　出处：《南京中医药大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus, T2DM)是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病,属于中医“消渴病”范畴。近代医家张锡纯提出消渴“消渴一证,古有上中下之分,谓其证皆起于中焦而极于上下”,揭示了消渴(T2DM)病位、病性与病势,有鉴于此,本文提出消渴发病与“脾”密切相关,主要是由于脾失运化导致的机体水液代谢与输布、饮食精微转输与利用的紊乱及不平衡状态所致。现代医学认为T2DM同时伴有因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质异常代谢,胰岛细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是T2DM的两大病理生理基础。目的：本研究提出从“脾”论治消渴(T2DM)的学术观点,采用“运脾津”治则指导下研制的药物津力达颗粒作为药物干预,通过建立T2DM大鼠模型,观察糖尿病胰岛功能病变特征及津力达颗粒的干预作用及机制；高脂饮食诱导建立胰岛素抵抗大鼠模型,观察津力达颗粒对糖脂代谢及胰岛素敏感性的干预作用及机制；建立软脂酸诱导的INS-1细胞损伤模型,观察津力达颗粒对INS-1细胞的保护机制。通过上述整体动物和离体细胞实验研究,以期为消渴(T2DM)的治疗提供有效方法与方药,同时也为消渴病从“脾”论治提供实验支持。方法：本研究分为以下两部分内容：理论研究方法：本文系统梳理消渴病病名、病因、病机和治疗的历史源流,探析近代医家张锡纯提出的消渴“起于中焦而极于上下”理论及临证应用,从“脾”立论,提出“脾失健运、水谷津液代谢异常”是消渴病主要病机,“脾失健运、痰瘀阻络”是消渴病引发全身并发症主要病机,确立“运脾津”治则并综合治脾诸法：益脾气、养脾阴、燥脾湿、泄脾热、温脾阳、畅脾气、通脾络,形成津力达颗粒组方,分析津力达颗粒组方特点及其临床及实验研究进展,以期为消渴病治疗提供有效治法与方药。实验研究方法：1.滓力达颗粒对T2DM大鼠胰岛功能干预作用研究90只SD大鼠随机分为正常组、模型组、吡格列酮组(4.5 mg/kg体重)和津力达低、中、高剂量组(0.75、1.5、3.0g/kg体重),每组15只,除正常组外,其余各组予高脂饲料喂养。喂养6周后,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(30mg/kg)诱导T2DM模型,72h后血糖仪测定空腹血糖≥13.9mmol/L为模型成功,不符合标准者剔除。造模成功后给药6周,正常组和模型组给予等体积纯水灌胃。造模后除正常组外,其余各组继续予高脂饲料喂养。末次给药后禁食12h,10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血分离血清,全自动生化仪检测空腹血糖(FBG)、放射免疫法检测空腹胰岛素(FINS)以计算胰岛p细胞功能指数(HOMA-p);透射电镜观察各组大鼠胰岛p细胞超微结构变化；Westernblot方法检测胰腺组织胱天蛋白酶3 (Casepase3)、自噬相关蛋白(p62、Atg7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1)蛋白表达；免疫组织化学方法观察胰岛细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达。2.津力达颗粒对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢及胰岛素敏感性干预作用研究动物分组同上,每组10只,除正常组外,其余各组予高脂饲料喂养6周,行口服糖耐量实验判断动物是否造模成功,模型组空腹血糖13.9mmol/L、每个时间点血糖高于正常组且AUC面积与正常组有统计学差异,评价为模型成功。造模成功后给药6周,正常组和模型组给予等体积纯水灌胃。造模后除正常组外,其余各组继续予高脂饲料喂养。末次给药后禁食12h,10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血分离血清,检测FBG、FINS,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);全自动生化仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、游离脂肪酸(FFA)；油红O染色观察各组大鼠肝脏细胞脂滴沉积情况；透射电镜观察各组大鼠肝脏细胞超微结构变化；ELISA法检测血清大鼠血清抵抗素(Resistin)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFa)水平；Western blot检测肝脏细胞糖脂代谢相关通路(AMPK/ACC通路)中p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC蛋白表达、胰岛素信号相关通路(PI3K/Akt通路)中p-PI3K、 PI3K、p-Akt、Akt、GLUT4蛋白表达。3.津力达颗粒对软脂酸(PA)诱导的INS-1细胞损伤的干预作用研究体外培养INS-1细胞,以CCK-8方法检测不同浓度(100,200,300,400 μg/mL) JLD对INS-1细胞生存活性的影响以判定滓力达对细胞是否具有毒性；给予最适浓度JLD 4 h后,加入PA共同处理细胞24 h, CCK-8方法检测细胞活性,RT-PCR方法检测细胞凋亡相关蛋白(BAX、Bcl-2)、Atg7、Beclin-1基因表达；以CompoundC处理细胞,检测其对PA损伤下INS-1细胞p62基因表达的影响。结果：1.津力达颗粒对2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛功能干预作用研究结果：生化检测结果显示,与正常组比较,模型组血糖升高、胰岛素水平降低,胰岛p细胞功能指数降低(P0.01)用药组空腹血糖降低、空腹血清胰岛素水平及血清胰岛p细胞功能指数水平升高,其中津力达中、高剂量组与模型组比较具有统计学意义p0.05,P0.01)；电镜结果显示,与正常组比较,模型组大鼠胰岛p细胞超微结构损伤,各用药组大鼠胰岛p细胞超微结构损伤改善,胰岛p细胞病变减轻；Westernblot结果显示,与正常组比较,模型组凋亡相关蛋白Casepase3表达增加,自噬相关蛋白p62、LC3Ⅰ蛋白表达增加、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表达降低(P0.05,P0.01)；与模型组比较,用药组Casepase3表达降低,p62、LC3Ⅰ蛋白表达降低、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P0.05)；免疫组化结果均显示,与正常组比较,模型组中胰岛p细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达减少,与模型组相比,JLD组Beclin-1莨达增加,Westemblot结果显示变化趋势与免疫组化结果相同,且具有统计学差异(P0.05)。2.津力达颗粒对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢及胰岛素敏感性干预作用研究结果：生化检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平显著升高,HDL-C水平显著下降(P0.01)。与模型组比较,津力达低剂量组对FFA的调整作用具有统计学意义,津力达中、高剂量组对TC、TG、FFA的调整作用具有统计学意义俨0.05,P0.01)。胰岛素抵抗指数检测显示,实验末模型组大鼠HOMA-IR升高(P0.01),与模型组比较各用药组HOMA-IR降低,具有统计学意义(P0.05,P0.01)；油红O染色与电镜结果显示,模型组大鼠肝脏细胞中出现大量脂滴、肝细胞结构损伤,各用药组肝细胞内脂滴减少,大鼠肝细胞超微结构损伤改善。ELISA结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清Resistin、 IL6、TNFα水平升高(P0.01),与模型组比较,津力达中高剂量组Resistin、TNFα水平降低,津力达高剂量组IL6水平降低,具有统计学意义(P0.05,0.01)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肝脏p-ACC、p-AMPK蛋白表达降低(P0.01)；与模型组比较,用药组肝胸p-ACC、p-AMPK表达增加(P0.01)；与正常组比较,模型组大鼠肝脏p-PI3K、 p-Akt、GLUT4表达降低,用药组大鼠肝脏p-PI3K、p-Akt、GLUT4表达增加,具有统计学意义(P0.01)。3.津力达颗粒对软脂酸(PA)诱导的INS-1细胞损伤的干预作用研究结果：CCK-8结果显示,津力达各用药剂量组细胞较正常组细胞生存活性无统计学差异；PA损伤后INS-1细胞生存活性降低,BAX、Atg7、Beclin-1基因表达增加,Bcl-2基因表达降低(P0.01),用药后,细胞生存活性增加(P0.01),细胞BAX基因表达减少,Bcl-2、Atg7、 Beclin-1基因表达增加；CompoundC能阻断PA环境下津力达对p62基因表达的调节作用(P0.01)。结论：1.理论研究：本研究基于近代名医张锡纯《医学衷中参西录》提出的“消渴一证,古有上中下之分,谓其证皆起于中焦而极于上下”学术思想,在系统整理研究历代医家关于消渴病病名、病因、病机及治疗研究基础上,提出从“脾”论治消渴学术观点,指出机体水液代谢与输布、饮食精微转输与利用的紊乱及不平衡状态为其发病之关键,提出“脾失健运、水谷津液代谢异常”是消渴病主要病机, “脾失健运、痰瘀阻络”是消渴病引发全身并发症主要病机,确立“运脾津”治则并综合治脾诸法：益脾气、养脾阴、燥脾湿、泄脾热、温脾阳、畅脾气、通脾络,并据此形成津力达颗粒组方,为消渴病(T2DM)临床防治研究开辟了有效途径和药物。2.实验研究：体内实验表明,津力达颗粒有效调节T2DM大鼠血糖及胰岛素分泌,保护p细胞结构,维持胰岛功能,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞数量。同时调整胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢,调节血清脂肪因子及炎症因子,减轻肝脏脂质沉积,改善胰岛素敏感性,其机制可能与调节AMPK/ACC及PI3K/Akt信号通路有关。体外实验证实,津力达颗粒改善软脂酸诱导的INS-1细胞损伤,增加其生存活性,激活其自噬,机制可能与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)相关通路有关。通过以上实验研究佐证了消渴从“脾”论治的科学价值,验证了津力达在改善胰岛素抵抗、治疗T2DM方面的确切作用,为临床治疗提供了有效治疗药物。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R259

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