川芎嗪对组织工程神经修复周围神经缺损作用的实验研究

发布时间：2018-03-20 19:07

本文选题：周围神经损伤　切入点：神经干细胞　出处：《重庆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分川芎嗪对基因修饰或缺血缺氧损伤鼠胚神经干细胞的保护作用目的：构建SD乳鼠神经干细胞体外缺血缺氧损伤及基因修饰模型；探讨TMP对神经干细胞基因修饰与缺血缺氧损伤的保护作用，以及TMP促进神经损伤修复，发挥神经保护作用的可能机制，为TMP作为神经干细胞保护剂提供细胞生物学理论依据。方法：(1)分离SD乳鼠海马神经干细胞(NSCs)进行原代培养，将二代NSCs行神经巢蛋白(Nestin)及诱导分化后的神经丝蛋白（NF-200）与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光鉴定。取二代神经干细胞行携带EGFP基因的逆转录病毒转染并更换完全培养基，然后按TMP实验组、基因修饰对照组（GM control）、溶媒对照组（Vehicle control）分组，同时设正常对照组（Normal control）。其中TMP实验组在DMEM/F12培养基中分别加入工作浓度为50、100、200和300μg/ml的TMP，溶媒对照组在DMEM/F12培养基中加入0.1%DMSO作为溶剂对照，正常对照组为未行基因修饰的二代神经干细胞。各组均在常规条件培养箱中培养72h。通过MTT比色法、锥虫蓝染色计数及流式细胞仪检测神经干细胞活力和损伤凋亡情况，Quantitative real-time PCR和Westernblotting方法检测凋亡相关因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达。另取二代NSCs分为TMP实验组（TMP group）、缺血缺氧对照组（OGDcontrol）、溶媒对照组（Vehicle control）和正常对照组（Normalcontrol）分别培养6h。其中缺血缺氧对照组、溶媒对照组和TMP实验组均采用OGD（oxygen-glucose-deprivation）法构建体外缺血缺氧损伤模型，溶媒对照组在缺血缺氧造模前即给予0.1%DMSO作为溶剂对照，TMP实验组则在造模前即刻分别加入工作浓度为50、100、200和300μg/ml的TMP，直至造模结束。正常对照组则不作任何处理在常规条件下培养6h。通过MTT比色法、锥虫蓝染色计数及流式细胞仪检测神经干细胞活力和损伤凋亡情况，Quantitative real-time PCR和Western blotting方法检测凋亡相关因子Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达。结果：（1）与正常对照组比较，溶媒对照组和基因修饰对照组NSCs活力均显著降低，细胞死亡率及细胞凋亡率均显著增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表达下调，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达上调（均P＜0.05）；但基因修饰对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异（均P＞0.05）；与基因修饰对照组比较，TMP实验组呈一定浓度依赖性，能浓度依赖地减少细胞死亡率及凋亡率，增强细胞增殖活性，且TMP可显著上调基因修饰后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表达水平，下调Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平，但基因修饰对照组和50、100μg/mlTMP组间无明显统计学差异（P＞0.05），200μg/mlTMP组与300μg/mlTMP组间未见明显统计学差异（P＞0.05）。（2）与正常对照组比较，溶媒对照组和缺血缺氧对照组NSCs活力均显著降低，细胞死亡率及细胞凋亡率均显著增高（均P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2mRNA和蛋白表达下调，促凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达上调（均P＜0.05）；但缺血缺氧对照组与溶媒对照组组间比较上述指标无明显差异（均P＞0.05）；与缺血缺氧对照组比较，TMP实验组呈一定浓度依赖性，能浓度依赖地减少细胞死亡率及凋亡率，增强细胞增殖活性，且TMP可显著上调基因修饰后NSCs中Bcl-2mRNA和蛋白表达水平，下调Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平，但缺血缺氧对照组和50、100μg/mlTMP组间无明显统计学差异（P＞0.05），200μg/mlTMP组与300μg/mlTMP组间未见明显统计学差异（P＞0.05）。结论：TMP能够浓度依赖性地对基因修饰后或缺血缺氧损伤的NSCs发挥保护作用，且该作用与其调控凋亡相关因子Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达，抑制细胞凋亡有关，这可能是TMP对周围神经系统发挥保护作用的相关机制之一。第二部分含川芎嗪培养液对组织工程化神经桥接物生物学特性的影响目的：化学法萃取Wistar大鼠脱细胞坐骨神经，构建种植基因修饰神经干细胞的组织工程化神经桥接物，探讨含TMP培养基对桥接物生物学特性的影响，为移植修复周围神经缺损提供理想的桥接体。方法：（1）12只成年健康Wistar雄性大鼠，切取双侧坐骨神经（共24条），每条长约2cm，其中20条按下列顺序进行化学处理:剥除外覆结缔组织，无菌蒸馏水清洗3次。放入3%TritonX-100中震荡24h后无菌蒸馏水清洗3次。放入4%脱氧胆酸钠中室温下震荡24h后无菌蒸馏水清洗3次。④重复2~3步骤，直至形成的去细胞神经呈乳白色、半透明样。HE染色、透射电镜扫描观察化学去细胞神经组织结构。⑤将化学去细胞神经放入DMEM/F12液中4℃保存备用。（2）取12条去细胞神经水化后在显微镜下用微量加样器注入10ul基因修饰神经干细胞悬液(2106/ml)后分I、II、III三组，I、II组各5条，III组2条，其中I、II组分别在常规DMEM/F12完全培养基和添加有200μg/mlTMP的完全培养基中继续培养1周；取I、II、III三组各2条切片行荧光显微镜、HE染色与免疫组化（Nestin、NF-200、GFAP）染色观察细胞分布与支架结构。（3）另取SD大鼠24只分A、B、C、D4组，每组6只，分别将4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神经、I组组织工程化神经、II组组织工程化神经及同种异体SD大鼠坐骨神经依次包埋于皮下，7天后取出各组移植神经行HE染色光镜观察及CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数量检测。另取SD大鼠24只分A、B、C、D4组，每组6只，分别将4℃保存1周Wistar大鼠坐骨神经、I组组织工程化神经、II组组织工程化神经及同种异体SD大鼠坐骨神经依次包埋于皮下，7天后取出各组移植神经行HE染色光镜观察及CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数量检测。结果：去细胞神经的横切片上可见神经外膜和神经束膜形成的圆形结构,其内部为松散的胶原成分髓鞘及细胞成分基本消失。神经外膜和细胞基底膜结构均较完整。纵切片上可见较多整，齐排列的管道样结构，基本无细胞成分。注射神经干细胞后纵切片上可见神经外膜下和束膜间有较多细胞成份，分布不均。培养1周后两组均有较多增殖与分化神经细胞，基因修饰神经干细胞在去细胞桥神经中生长良好，并且有迁移成行的特性，但II组更明显，与I组差异有显著性（P＜0.05）。皮下包埋后光镜下见蓝色淋巴细胞浸润依次减少，A、B、C组间均有显著差异。C、D组间无显著差异。神经内CD4+和CD8+淋巴细胞侵润数A组最多，D组最少，，A、B、C组间均有显著差异。C、D组间无显著差异。结论：异体神经化学萃取法可去除神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构，并且对神经基底膜主要成分-层粘连蛋白无明显影响。种植神经干细胞并在含TMP培养基中培养后制作的组织工程化神经具有较低免疫原性及正常神经的三维结构，可能成为一种理想的组织工程化人工神经，作为修复周围神经缺损的桥接物。第三部分川芎嗪预处理组织工程化神经桥接物修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究目的：研究川芎嗪预处理对组织工程化神经桥接物修复大鼠1.5cm坐骨神经缺损的效果。方法：分别按前述方法制作基因修饰的SD大鼠神经干细胞、脱细胞的Wistar大鼠坐骨神经、种植神经干细胞并在含川芎嗪培养基中共培养1周的组织工程化神经。将55只200-250克成年雌性SD大鼠分为A、B、C、D共4组，A、B、C组各15只，D组10只，实验侧均为右后肢坐骨神经。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,显露坐骨神经,从梨状肌下缘0.5cm处切除神经1.5cm,分别用4种移植物桥接大鼠1.5cm坐骨神经缺损:含川芎嗪的组织工程化神经组（A组）、脱细胞异体神经组（B组）、异体神经组（C组）、自体神经组（D组）。术后A组术侧小腿三头肌内注射TMP液（16mg/kg/日），其余各组（B、C、D组）注射相同体积0.9%NS，连续注射12周至实验结束。术后2周、12周通过大体观察、神经电生理检测、肌肉湿重称重、荧光显微镜观察、辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果：术后12周大体观察发现A、D组实验侧足趾明显散开，足趾印迹分散，恢复足爪着地行走，右后肢蹬力良好，明显优于B、C组；A组坐骨神经功能指数测定、运动神经传导速度和肌肉湿重恢复均优于B、C组（P0.05），略差于D组（P0.05）；荧光显微镜与免疫组化染色检测发现，NSCs能在体内存活、迁移并分化为神经元和胶质细胞，A组优于B、C组；术后12周辣根过氧化物酶（HRP）逆行示踪检测提示A组脊神经节中HRP标记的细胞数较B、C组多（P0.05），甲苯胺蓝染色发现A组移植段再生神经纤维较多,以有髓神经纤维为主，明显优于B、C组（P0.05）。结论：种植神经干细胞并在含川芎嗪培养液中培养1周的脱细胞异体神经构成的组织工程化神经桥接物能有效修复大鼠坐骨神经缺损，促进周围神经再生及下肢运动功能的恢复。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R745

【参考文献】