急性脊髓损伤脊髓组织、血浆和脑脊液代谢组学平行研究

发布时间：2018-03-21 19:32

本文选题：脊髓损伤　切入点：代谢组学　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种高致残率疾病,涉及细胞毒性、氧化应激和免疫-内分泌等多个病理机制[1-3],其病理过程的复杂性不仅取决于初始的机械损伤,更取决于缺血、缺氧、自由基形成、兴奋性毒性等继发损伤。目前对于脊髓损伤的治疗尚缺乏有效手段,继发损伤机制尚未完全明确,脊髓损伤后许多血清生化指标发生变化,但却很难发现特征性生物标志物[1,2,4]。无法对脊髓损伤严重程度进行准确判断和预测。代谢组学(metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物样本所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理刺激、遗传修饰、病理生理变化相对关系的研究方式[5,6],是系统生物学重要组成部分。其高通量鉴定、定量代谢物的方法为研究脊髓损伤所涉及的复杂的代谢途径和大量的代谢产物供了有效手段。近年来已有学者应用不同的代谢组学技术对脊髓损伤后患者或模式动物生物样本进行分析,建立了相应的代谢组学模型,能够对不同损伤程度的脊髓损伤进行区分,但大多数学者均采用单一生物标本研究策略,筛选潜在标志物以及可能涉及的病理生理过程,尚无对体液标本与脊髓组织进行横向研究,体液标本是否能够真实反映损伤后脊髓组织代谢改变以及不同生物样本间代谢相关关系都尚未明确。研究目的:本研究拟在建立大鼠脊髓损伤模型的基础上,运用GC-MS代谢指纹技术对脊髓损伤模型动物的血浆、脑脊液和脊髓组织3类生物标本进行非靶向分析,研究脊髓损伤后不同生物样本中代谢改变及相关关系。建立猕猴脊髓全横断损伤模型,验证血浆(血清)生物样本在脊髓损伤代谢组学研究中的可靠性和稳定性。研究方法:1.大鼠脊髓损伤模型的建立选用成年健康SD大鼠60只随机分为正常对照组、6小时组、24小时组以及72小时组,每组15只。损伤组应用NYU脊髓损伤模型打击器建立T9节段MASCIS脊髓损伤模型,打击杆重量10g,初始高度25mm。通过建立模型动物质量评定标准评价模型质量,符合实验设计标准的模型动物用以后续研究。2.生物标本获取脊髓损伤大鼠麻醉后,将头部固定于立体定向架,应用1ml注射器连接27G头皮针行枕大池穿刺,缓慢抽取脑脊液,量应大于100μl,放入EP管中储存。采血针于胸前心尖部行心脏穿刺,成功后连接肝素锂抗凝真空采血管采集动脉血2ml,静置10分钟后离心取血浆。解剖暴露脊髓,获取打击中心两侧各1cm内脊髓组织,置于冻存管内放入液氮中速冻。所有标本-80℃储存备检。建立生物样本质量评价标准,对所获取生物标本进行评估,因后续研究需进行不同生物样本代谢相关分析,来源于同一动物的所有标本如有一种类型标本出现不合格则该动物所有标本均需废弃。3.代谢组学分析对获取的脊髓损伤大鼠生物标本进行衍生化处理,再通过气相色谱串联质谱技术进行分析,得到质谱谱图,通过峰识别、峰过滤、峰对齐处理后获得质核比、保留时间、峰面积及Fisher率等GC-MS原始数据。通过SIMCA-P软件对其进行多维数据分析,排除异常标本,查找代谢差异物,鉴定脊髓损伤相关代谢通路。4.不同生物标本间代谢相关分析将谱峰数据与实验室自建标准物质谱库进行对比,指认代谢物,对各组织标本进行靶向代谢组学分析,横向对比并筛选出体液与脊髓组织中均受脊髓损伤影响的共同代谢通路,对通路中关键差异代谢物进行相关分析,以考察体液作为脊髓损伤代谢组学分析标本的可靠性与相关性。5.脊髓损伤猕猴血清代谢组学分析通过建立猕猴脊髓损伤动物模型获取损伤前、损伤后3小时以及损伤后3天的血清标本,应用GC-MS非靶向代谢指纹技术对其进行分析,查找差异代谢物及脊髓损伤相关代谢通路,并进一步与脊髓损伤大鼠血浆标本代谢数据进行对比,以评价血浆(血清)作为脊髓损伤代谢组学分析标本的潜力与可靠性。研究结果:每组随机选取12套共48套生物标本用于GC-MS分析,血浆标本获得谱峰478个,通过PCA模型排除异常标本3个,应用OPLS-DA模型及组间比较筛选差异代谢物34种,鉴定脊髓损伤相关代谢通路6条;脑脊液标本获取谱峰359个,通过PCA模型排除异常标本2个,应用OPLS-DA模型及组间比较筛选差异代谢物20种,鉴定脊髓损伤相关代谢通路2条;脊髓组织标本获取谱峰673个,应用OPLS-DA模型及组间比较筛选差异代谢物40种,鉴定脊髓损伤相关代谢通路14条。组织间代谢组学平行分析显示:血浆与脊髓组织共有指认代谢物占脊髓指认代谢物的88.5%,脑脊液与脊髓组织共有指认代谢物占脊髓指认代谢物的75.4%。血浆与脊髓组织共有的受影响代谢通路占脊髓组织调整通路的42.9%;脑脊液与脊髓组织共有的受影响代谢通路占脊髓组织调整通路的23.8%。丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢在本研究脊髓损伤大鼠各种标本中均显著改变,其关键代谢物丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸在大多标本中成为显著差异代谢物。对5只脊髓全横断损伤猕猴脊髓损伤前后3时间点血清标本进行代谢组学分析,筛选并鉴定出受脊髓损伤影响显著改变的代谢通路14条,其包含所有前述大鼠血浆脊髓损伤相关代谢通路。研究结论:体液或脊髓组织均可单独应用于脊髓损伤代谢组学研究,因选取的标本不同得出的差异代谢物与受脊髓损伤影响的代谢通路在数量和种类上不尽相同,脊髓组织代谢改变更直接的反映了损伤局部病理生理变化,体液代谢改变在部分反映脊髓损伤局部代谢特征的同时还能同时反映出整个神经系统甚至生物体应对损伤的代谢改变。血浆(血清)与脊髓组织代谢相关程度更高,反应灵敏,虽然易受机体其它因素影响,但仍能表现出较高的稳定性,适合进行脊髓损伤程度代谢生物标志物的筛选。脑脊液与脊髓组织代谢相关程度相对较低、反应滞后,但其相对封闭、保守、稳定的特点更易于准确反映脊髓损伤后脊髓局部长时间段代谢变化,适合用于脊髓损伤预后预测的代谢生物标志物筛选。脊髓损伤组织的代谢变化直接反映了损伤局部代谢特征,适合进行病理生理及损伤机制代谢组学研究。在研究中我们还发现甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸代谢两条代谢通路在脊髓损伤后不同生物样本中均显著的改变,且其关键代谢物在各组织中相关性强,是脊髓损伤代谢研究应重点关注的代谢通路,其在脊髓损伤中起到的作用与机制尚不十分明确,还需进一步深入研究。综上所述,血浆(血清)与脑脊液标本均能反应脊髓损伤局部代谢特征,适合进行脊髓损伤代谢组学研究,但应根据研究目的选取相应的标本,以获得更可靠结论。在脊髓损伤生物标志物筛选时,将血浆(血清)和脑脊液相结合进行代谢组学分析不失为一种扬长避短的解决方案。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.2

【参考文献】