帕瑞昔布减轻过氧化氢诱导的大鼠星形胶质细胞氧化应激损伤的作用及机制研究

发布时间：2018-03-24 10:33

本文选题：氧化应激　切入点：帕瑞昔布　出处：《安徽医科大学》2015年博士论文

【摘要】：术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指麻醉及手术后数天至数月内发生的并发症,常发生于老年术后病人,主要表现为急性精神紊乱综合征,如意识水平、认知能力、定向思维、学习记忆以及睡眠等方面的紊乱,轻者持续时间短,可自愈,严重时会导致伤口愈合延迟、并发症增多、住院天数延长、医疗费用增加等,甚至影响病人出院后的生活质量以及死亡率增加,目前确切病因仍不很明确,给临床预防和治疗POCD带来一定的困难。已有的研究表明POCD的发生与手术因素、年龄因素、麻醉用药、预先存在的脑、心脏、血管疾病、低教育水平和术后并发症等多种因素有关,此外,氧化应激在大脑中,特别是在海马组织可能参与POCD的发病机制。氧化应激被认为是参与大脑急性病理状态的细胞损伤过程和许多退行性疾病如阿尔茨海默病的神经病理学改变。氧化应激相关的细胞损伤潜在的分子机制仍未完全阐明。目前POCD日益受到研究者的关注。如何早期预测与发现可能出现POCD的患者,并给予及时的预防与治疗,是提高患者生活质量的关键所在,寻找新的治疗靶点以改善患者的预后成为目前研究的焦点。星形胶质细胞(astrocyte, AS)作为中枢神经系统内在数量上占绝对优势的大胶质细胞,广泛地分布于神经元之间,不仅为神经元提供能量和代谢的支持,而且在形成和维持血脑屏障、调节突触可塑性等方面发挥重要作用。作为大脑支持性和代谢细胞,星形胶质细胞是大脑中枢神经系统(central nervous system, CNS)的关键细胞,参与细胞外环境的维护和生理及病理条件下细胞间通讯的稳定]。星形胶质细胞为神经元提供机械和代谢支持。许多功能都与星形胶质细胞密切相关,包括离子体内平衡,调节细胞外谷氨酸浓度以及神经营养因子的合成,参与大脑的生理抗氧化防御等。帕瑞昔布,非甾体类抗炎药(nonsteriodial anti-inflammatory drug, NSAID),可选择性地阻断环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)的作用,在术后疼痛的研究中备受关注。近年来研究表明,帕瑞昔布有神经保护作用,但迄今为止仍缺乏相关具体机制的研究。帕瑞昔布对过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)诱导的原代培养的大鼠星形胶质细胞的影响鲜有研究。如果有保护作用的话,帕瑞昔布不但可以作为止痛剂,同时可以改善氧化应激反应对POCD的影响。本研究给予原代培养的大鼠星形胶质细胞强氧化剂H202处理,造成氧化损伤,建立氧化应激模型。基于此模型,研究帕瑞昔布对H202诱导的星型胶质细胞的神经保护作用,并进一步探讨其保护作用机制。论文共分两部分：第一部分探讨大鼠星形胶质细胞的原代培养及星形胶质细胞氧化应激模型的建立；第二部分证实帕瑞昔布减轻H202诱导的大鼠星形胶质细胞氧化应激损伤的作用并探讨其作用机制。第一部分大鼠星形胶质细胞的原代培养及星形胶质细胞氧化应激模型的建立目的：探究大鼠原代星形胶质细胞的分离、纯化及体外培养方法,加入H202引起星形胶质细胞的氧化应激损伤,建立氧化应激模型,为进一步深入研究氧化应激损伤,筛选有效的抗氧化神经保护剂提供重要的实验基础。方法：采用新生SD大鼠海马进行星形胶质细胞原代培养和传代培养。无菌条件下取出生后12～24 h的SD大鼠海马组织,剪碎组织后用胰蛋白酶消化,结合吸管机械吹打将细胞打散,离心后用DMEM/F12混合培养液制成单细胞悬液,接种在无底物黏附的玻璃培养瓶中,置37℃,5%C02培养箱中培养。将培养9～12d的细胞,置于恒温振荡培养箱中,37℃,200r/min,培养12 h。倒除含有脱落细胞的悬液,并用D-Hank's平衡盐液洗涤细胞两次,目的是去除小胶质及少突胶质细胞等干扰细胞,并且加入含10%FBS的DMEM/F12培养液继续培养,待细胞恢复正常并进入对数生长期后传代培养,并进行胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体免疫组化鉴定。100μmol/LH2O2作用星形胶质细胞24 h,四甲基噻唑氮蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法进行细胞活力分析；倒置显微镜下观察细胞形态改变；2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(2,7-dichlordi-hydrofluorescein, DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量。流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：通过恒温震荡和传代后得到了形态典型,含量较高的大鼠星形胶质细胞。经GFAP染色,原代培养的第一代星形胶质细胞,GFAP阳性细胞数达85%以上；第二代星形胶质细胞培养后GFAP阳性细胞数达90%以上,第三代细胞GFAP阳性细胞数达98%以上,均为胞浆着色,胞核未见着色,获得纯度较高的星形胶质细胞,可用于实验,本实验使用第四代到第七代星形胶质细胞进行研究。H202干预组星形胶质细胞与对照组相比,细胞活力下降,细胞形态发生明显变化,失去结构完整性,部分细胞死亡,漂浮在正常细胞层上面。ROS检测发现,H202组荧光强度增强,ROS生成增多。流式细胞仪检测细胞凋亡发现,H202处理组细胞凋亡率明显增加。结论：本实验成功进行了大鼠海马组织原代星形胶质细胞的分离、纯化、体外培养及鉴定,建立了原代SD大鼠海马星形胶质细胞体系。使用H202引起星形胶质细胞氧化损伤,造成氧化应激模型,为进一步观察药物对星形胶质细胞氧化应激的保护作用打下基础。第二部分帕瑞昔布减轻过氧化氢诱导的大鼠星形胶质细胞氧化应激损伤的作用及机制研究目的：探讨帕瑞昔布对H202诱导的原代培养的大鼠星形胶质细胞的影响,并为帕瑞昔布的临床脑保护作用提供理论依据。方法：80μmol/L和160μmol/L的帕瑞昔布预处理大鼠星形胶质细胞24 h后,再加入100μmol/L H2O2作用24 h,MTT法进行细胞活力分析；倒置显微镜下观察细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞内ROS含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化检测水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4)蛋白表达情况,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-assotiated X protein, bax)、B细胞淋巴瘤-2 (B-celllymphoma-2, bcl-2) mRNA的表达,蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白的表达。结果：MTT结果显示,帕瑞昔布预处理组吸光度值明显增加,与H202组相比,细胞生长抑制率明显改善,帕瑞昔布预处理组与正常对照组相比无显著统计学意义。倒置显微镜下观察帕瑞昔布预处理组与H202组相比,细胞形态基本完整,大部分细胞突起依然存在。流式细胞仪进行ROS检测,H202组与对照组相比,荧光强度增强,ROS生成明显增多,而帕瑞昔布预处理组能明显阻止星形胶质细胞内ROS水平增加,其中160μmol/L帕瑞昔布预处理组细胞内ROS水平与H202组有显著统计学意义。H202处理组星形胶质细胞的凋亡率与对照组相比明显增加,而帕瑞昔布组预处理可明显减少细胞凋亡率,与H202组相比,差异有统计学意义。免疫组化结果显示：H202组星形胶质细胞内AQP4蛋白表达明显升高,而80μmol/L和160 μmol/L帕瑞昔布预处理组AQP4蛋白表达与H202组相比明显下降。]RT-PCR结果表明：H202组星形胶质细胞bax mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA表达明显降低,而160μmol/L帕瑞昔布预处理组baxmRNA表达较H202组减少,bcl-2 mRNA表达明显增加。Western blot结果表明H202组星形胶质细胞BDNF蛋白表达较对照组相比明显减少,而帕瑞昔布预处理组BDNF蛋白表达较H202组明显增加。结论：帕瑞昔布对H202诱导的大鼠星形胶质细胞氧化损伤具有保护作用,其机制可能与降低细胞ROS水平,减少细胞凋亡率,抑制AQP4表达,减少bax表达,增加bcl-2和BDNF表达有关。这表明帕瑞昔布可能发挥神经保护作用。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614

【参考文献】