底板反应蛋白（SPON1）对骨肉瘤转移的影响及机制研究

发布时间：2018-03-26 05:55

本文选题：骨肉瘤　切入点：SPON1蛋白　出处：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：骨肉瘤(Osteosarcoma)也称为成骨肉瘤,是发生于儿童和未成年人的常见恶性肿瘤,约占骨原发性肿瘤的20%。骨肉瘤组织学特点是间充质干细胞或成骨细胞分化障碍,能够直接生成骨或者骨样组织,侵袭性强并且早期就易出现远处转移。骨肉瘤的组织学分型为(传统型,毛细血管扩张型,骨旁骨肉瘤,骨膜骨肉瘤,低级中央,小细胞型)。最常见的为传统型,按照细胞组织形态又分为:骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型,此三型在临床转归上没有明显差异。由于其恶性程度高、侵袭性和转移性强,发病早期即可发生转移,易转移到肺和骨,确诊的患者5年生存率只有60%,10年生存率不超过30%。约15-25%的患者发生肺转移,导致化疗失败和不良预后。此外,近90%骨肉瘤患者有转移或复发,甚至是彻底的外科手术切除原发肿瘤后。尤其在发生转移的患者中,5年生存率至今不足30%。大多数原发性骨肉瘤的病因不明。细胞遗传学研究显示在原发性骨肉瘤患者体内基因(包括很多染色体)发生了一系列复杂的变化,其发生和发展可能与这些基因的失调控有关,但是并没有具体模式。因此,有必要找到骨肉瘤与正常组织间的差异表达基因,确定骨肉瘤发生、发展与转移的分子机制,为抑制骨肉瘤发生和转移探索新的治疗方法。底板反应蛋白(SPON1),即F-spondin,一种分泌型细胞外基质糖蛋白,最初是从脊椎动物的胚胎底板分离出来。研究发现重组SPON1蛋白能促进神经细胞粘着和神经元生长,说明SPON1有调节胚胎中枢神经系统轴突生长的作用。SPON1还能促进血管平滑肌细胞增殖并且抑制血管生成。除此之外,还发现SPON1在很多其他组织中有表达,如卵巢、胚胎生长板软骨、牙周组织、骨关节炎软骨。但是,SPON1在骨肉瘤组织中是否有表达,表达量如何,还不清楚。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一组含有锌离子和钙离子依赖性内肽蛋白水解酶,组成成员有20多个,主要作用是降解细胞外基质的一些重要的蛋白酶类,使细胞外基质维持动态平衡。以往的很多研究证实MMPs家族在肿瘤的增殖、血管形成、侵袭和转移中起重要作用。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是MMPs家族中的重要一员,主要降解细胞外基质中的主要成分Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶,在肿瘤的发生发展和侵袭转移中起重要作用。肿瘤增殖抗原Ki67参与多个细胞内信号通路,是反映细胞增殖活性的敏感指标,在增殖期细胞表达,而在静止期细胞不表达,半衰期短,在多种恶性肿瘤中呈现过表达现象。着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内的一种蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK),与细胞的粘附功能密切相关。肿瘤细胞转移时,整合素通过使异质性黏附升高,同质性黏附降低,促进肿瘤细胞迁移和侵袭。FAK是整合素信号通路中的关键分子,参与了肿瘤细胞的多个信号传导途径。肉瘤激酶(sarcoma,Src)家族成员是由原癌基因编码的位于细胞质的非受体型酪氨酸蛋白激酶,分子量为60k D,是第一个被发现具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白,参与细胞内多条信号传递途径。本研究的目的是确定骨肉瘤中SPON1的表达模式和分子机制。我们用人高转移性骨肉瘤细胞系(KHOS、KRIB)和人低转移性骨肉瘤细胞系(HOS、U2OS)进行研究。并用si RNA转染技术证明SPON1、Fak、Src信号通路的作用机制。开展临床骨肉瘤样本SPON1的表达的免疫组化分析,研究SPON1水平分别和MMP9和Ki67表达的关系。SPON1对细胞迁移和侵袭的影响。最后,我们的研究表明,SPON1/Fak/Src相联通路可能是控制骨肉瘤转移的一个有效途径。第一部分探讨SPON1是否为人转移性骨肉瘤和人非转移性骨肿瘤的差异表达基因目的:1确定4种骨肉瘤细胞系KHOS、KRIB、HOS、U2OS符合人高转移性骨肉瘤细胞系和人低转移性骨肉瘤细胞系的划分,以便进行下一步实验。2确定从GEO数据库中筛选出的SPON1基因是人高转移性骨肉瘤与人低转移性骨肿瘤间的一种差异基因。3探讨高转移性的人骨肉瘤标本与低转移性的人骨软骨瘤标本中SPON1表达是否存在差异,以及SPON1和两种肿瘤标志物MMP9、Ki67间的关系。方法:1 GEO数据库高频率突变基因附近核苷酸序列进行GC%含量分析,同时选取高突变基因正常位点作为参照,寻找差异表达基因,并进行分析。2根据文献选择4种细胞系作为实验对象,其中KHOS和KRIB为人高转移性骨肉瘤细胞系,HOS和U2OS为人低转移性骨肉瘤细胞系,并用细胞迁移及侵袭实验验证。3用蛋白免疫印记实验(Westernblot)检测4种人骨肿瘤细胞系(人低转移性骨肉瘤细胞系HOS和U2OS;人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS和KRIB)中SPON1蛋白表达及差异。4免疫组织化学法检测72例人骨肉瘤组织芯片和24例人骨软骨瘤组织芯片中SPON1阳性表达率有无差异,组织芯片用二甲苯脱蜡、梯度酒精水化。磷酸盐缓冲液(PBS)中洗3遍后,在含有0.01M柠檬酸钠-盐酸缓冲液中微波加热15分钟,进行抗原修复。PBS冲洗后,组织切片用0.3%过氧化物酶灭活溶液封住内源性过氧化物酶(封酶),然后分别用SPON1一抗,MMP9一抗和Ki67一抗孵育,4°C过夜。PBS洗3遍,切片用辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗中温育,加3,3’-二氨基联苯胺磷酸盐显色。苏木精复染。染色阳性的肿瘤细胞百分比来计算总的免疫染色评分。阳性百分比的分数如下:0-10%为0分;10%-30%为1分;30%-60%为2分;超过60%为3分。0-1分定义为低表达,2-3分定义为高表达。结果:1 GEO数据库(GSE49003)中高频率突变基因附近核苷酸序列进行GC%含量分析,同时选取高突变基因正常位点作为参照,得出SPON1可能为人高转移性骨肉瘤和人低转移性骨肿瘤间的差异基因。2细胞迁移及侵袭实验结果显示,根据文献选出的4种人骨肉瘤细胞系,其中KHOS和KRIB为人高转移性骨肉瘤细胞系,HOS和U2OS为人低转移性骨肉瘤细胞系,可以作为研究人骨肉瘤细胞转移的实验细胞系。3通过蛋白免疫印迹实验在4种人骨肉瘤细胞系中均检测到SPON1蛋白。但是和人低转移性骨肉瘤细胞系HOS和U2OS相比,在KHOS和KRIB两种人高转移性骨肉瘤细胞系中SPON1蛋白高表达。4免疫组织化学显示,在转移率高的人骨肉瘤标本中SPON1蛋白阳性表达率明显高于转移性低的人骨软骨瘤标本,表明SPON1和肿瘤的转移密切相关。另外,用斯皮尔曼等级相关系数统计分析得出,在人骨肉瘤标本中SPON1和MMP9间有显著正相关(P0.001,R=0.745),而不是Ki67(P=0.359)。第二部分探讨SPON1在骨肉瘤细胞和体内肿瘤转移和侵袭中的作用目的:1研究SPON1蛋白在骨肉瘤细胞转移和侵袭中的作用。2在裸鼠动物模型上观察异种移植肿瘤生长情况及SPON1在体内肿瘤转移中的作用。方法:1 si RNA转染,生长曲线及MTT方法测定细胞生长及增殖情况:1.1根据si RNA设计原则,体外构建并合成2种沉默SPON1基因表达的si RNA-SPON1(si-SPON1-1、si-SPON1-2)和1种阴性对照si RNA(si-Ctrl)。通过脂质体载体转染人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS和KRIB,沉默细胞中SPON1基因;1.2 Westernblot实验检验干扰效率;1.3生长曲线及MTT实验检测si RNA脂质体载体特异性沉默SPON1基因对KHOS和KRIB细胞的生长和增殖情况有无影响;1.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验检测SPON1沉默后的人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS与KRIB细胞迁移与侵袭能力的变化。2用人重组SPON1蛋白培养人低转移性骨肉瘤细胞系HOS和U2OS:2.1将人重组SPON1蛋白稀释为5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/l,Westernblot实验鉴定。2.2 MTT法测定不同浓度(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)人重组SPON1蛋白对两种细胞系的生长和增殖情况有无影响;2.3 Transwell细胞迁移和侵袭实验检测不同浓度(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)人重组SPON1蛋白培养人骨肉瘤细胞系HOS与U2OS后,对两种细胞的迁移与侵袭能力的影响。3裸鼠体内肿瘤发生和转移实验:收集si RNA-SPON1-1转染的KHOS细胞和阴性对照si-Ctrl转染的KHOS细胞,制备细胞-基质胶混合物,注入麻醉裸鼠的胫骨近端(n=5只/组)。接种后6周,收集原位肿瘤和鼠肺。称重原位肿瘤,并在解剖立体显微镜下查数肺转移瘤结节的个数。最后,原位肿瘤及肺部转移瘤用10%中性缓冲福尔马林固定,石蜡包埋,5μm厚切片,HE染色。观察异种移植肿瘤生长情况及SPON1在体内肿瘤转移中的作用。结果:1 Westernblot实验结果显示:两种SPON1 si RNA(si-SPON1-1,si-SPON1-2)转染人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS和KRIB,特异性沉默了SPON1基因的表达,两种细胞的SPON1蛋白表达明显下降。2生长曲线实验MTT实验均表明si RNA脂质体载体转染特异性沉默SPON1基因对KHOS和KRIB细胞的生长和增殖情况无明显影响(P0.05);不同浓度人重组SPON1蛋白培养对人低转移性骨肉瘤细胞系HOS和U2OS的生长和增殖情况无明显影响(P0.05)。3与对照细胞比较,沉默SPON1基因降低人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS和KRIB细胞分解细胞基质并侵袭到下层小室的能力,迁移及侵袭到下层小室的细胞明显减少。重组人SPON1蛋白促进人低转移性骨肉瘤细胞系HOS和U2OS细胞迁移和侵袭,并呈剂量依赖关系。4将沉默SPON1基因的KHOS细胞和未沉默SPON1基因的KHOS细胞接种于麻醉裸鼠的胫骨近端,接种后6周,收集原位肿瘤和鼠肺。病理切片确认原位肿瘤为骨肉瘤,鼠肺肿瘤为骨肉瘤转移瘤。结果显示,在KHOS细胞中特异性沉默SPON1基因不影响异种移植肿瘤生长,但是对照组(未沉默SPON1基因的KHOS细胞接种)鼠的肺转移病灶均明显多于SPON1敲除组。第三部分探讨骨肉瘤细胞中SPON1与FAK\Src信号通路关系目的:研究SPON1促进骨肉瘤细胞转移是否与FAK\Src信号通路有关方法:1蛋白免疫印迹实验(Westernblot)检测特异性沉默SPON1基因的人高转移性骨肉瘤细胞系KHOS细胞中FAK、Src的磷酸化水平,再检测用不同浓度人重组SPON1蛋白培养人低转移性骨肉瘤细胞系HOS细胞中的FAK、Src的磷酸化水平。2为了进一步证明FAK和Src在SPON1引起的转移过程中的作用,用si RNA分别沉默两种人高转移性骨肉瘤细胞系HKOS和KRIB细胞中FAK基因和Src基因后,对两种细胞进行细胞迁移和侵袭实验。用人重组SPON1蛋白培养已经沉默FAK、Src基因的KHOS、KRIB细胞,观察其迁移及侵袭能力情况。结果:1在人高转移性骨肉瘤HKOS细胞,特异性沉默SPON1基因导致FAK和Src的磷酸化水平降低。用人重组SPON1培养人低转移性骨肉瘤细胞系HOS细胞,FAK和Src的磷酸化水平升高,并呈剂量依赖性关系。说明人骨肉瘤细胞转移性的高低与细胞内SPON1、FAK、Src均有关,FAK和Src的磷酸化水平与SPON1有关。2在沉默FAK和Src基因的HKOS和KRIB细胞,迁移和侵袭能力明显下降。用不同浓度人重组SPON1蛋白(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)培养已经沉默FAK、Src基因的KHOS细胞,其迁移及侵袭能力无明显改善。说明在HKOS和KRIB细胞,SPON1对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的增强作用由于沉默FAK和Src完全受阻。FAK/Src信号通路是SPON1增强骨肉瘤转移过程中的众多信号通路之一。结论:1 SPON1是人高转移性骨肉瘤细胞系和人低转移性骨肉瘤细胞系的差异表达基因,也是人转移性骨肉瘤和人非转移性骨软骨瘤间的差异表达基因,在骨肉瘤细胞迁移侵袭过程中可能具有重要的调控作用。并且发现SPON1水平与原发肿瘤细胞的MMP9表达密切相关。2在体内或体外实验中,通过沉默SPON1基因,使人高转移性骨肉瘤细胞系的转移和侵袭行为得到显著抑制;用人重组SPON1蛋白培养人低转移性骨肉瘤细胞,细胞的转移和侵袭能力明显提高。基于这一实验结果,我们推测,SPON1可能是作为骨肉瘤细胞转移过程中的一个调节因子来发挥作用。3 SPON1蛋白可显著提高FAK和SRc信号通路的磷酸化水平,从而促进细胞侵袭。FAK/Src信号通路是SPON1引起的骨肉瘤转移过程中的关键因子。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

【参考文献】