基于代谢组学的水产品物流相关技术研究

发布时间：2018-03-27 08:53

本文选题：代谢组学　切入点：机器学习　出处：《上海海洋大学》2016年博士论文

【摘要】：本文将代谢组学技术成功应用于水产品物流储运相关研究中。对于靶向代谢组学,本文将其应用于典型海洋贝类生物-扇贝的半无水活体保藏条件优化中。而对于非靶向代谢组学,本文将其应用于经过MS-222麻醉运输的鲫鱼复苏时间不足的判别方法的建立上。本研究将代谢组学技术这种新颖的研究方法的应用扩展到了水产品物流储运这个传统研究领域。使得代谢组学技术在应用上有了新的思路,同时对水产品物流储运相关研究中常被忽视的方面带来了更加深入和细节的视角。本研究的主要内容包括以下5个部分:1.典型贝类海洋生物活体贮藏过程生存能力和能量贮备物质的研究目标:为了探究半无水活体储藏过程中扇贝的存活能力,探明扇贝的半无水活体保藏在实际的商用条件下能够在经济上可接受的保藏时间,为下一步的靶向代谢组学研究的试验设计提供了参考。同时对于扇贝在半无水活体保藏的条件下其生理情况的变化,特别是呼吸作用和能量储备方面,进行了初步探索。方法:本研究对扇贝在5℃下半无水保藏进行了一系列天数的实验,直至其半数致死时间,对保藏过程中扇贝的存活曲线进行了测定。对用于测定生存率的样品,随机抽取其中的部分个体,测定了数个生化指标,包括糖原水平,乳酸水平和蛋白质水平结果:经过每日的存活率检测,绘制了其存活曲线。其中10%致死时间作为商业可接受到保藏时间,经测定为3天。而半数致死时间作为实验终止的时间,经测定为6天。保藏过程中,扇贝的糖原水平在每个时间点上相互之间没有统计学显著性差异。每日检测的扇贝乳酸水平,第一天的乳酸水平相对其实和第二天,其暂时性上升有着统计学显著性。每日的蛋白质水平没有统计学显著性差异。结论:扇贝在半无水储藏条件下的生存能力优秀。糖原水平的维持可能是因为糖原异生作用作用的加强。乳酸水平的暂时升高表明了扇贝在逆向环境应激的初始时间点上,其无氧呼吸的代谢模式发生了从乳酸通路到琥珀酸通路的切换。然而常规的生化指标检测只能提供非常有限的信息,需要引入下一章节中的靶向代谢组学方法。2.基于靶向代谢组学分析典型贝类海洋生物活体贮藏过程代谢特性的研究目标:进一步探究扇贝在半无水活体储藏过程中代谢模式变化的具体细节,对上一章中生化指标检测结果进行后续的阐明。再者,利用靶向代谢组学方法对扇贝半无水活体储藏过程中的生物标记物进行筛选,并基于此进行代谢通分析,力图阐明扇贝所受到的代谢通路扰动是否和相关逆向环境存在关联。方法:本研究对扇贝进行了为期3天,既前一章中所得到的10%致死时间,的半无水活体保藏。将其与对照组进行了基于氯甲酸甲酯衍生化的气相色谱-质谱分析。所得到的信息进行了基于主成分分析和偏最小二乘判别分析的多元统计分析方法的模式识别。依照主成分分析结果对数据进行过滤剔除离群样本。利用偏最小二乘判别分析的变量重要性投射值和t检验的p值对潜在的生物标记物进行筛选。最后依照生物标记物进行通路分析结果:经过了主成分分析的数据过滤后,偏最小二乘判别分析模型被成功建立。经过了特征变量的提取,与细胞呼吸相关的羧酸,包括苹果酸,富马酸和琥珀酸,C18:0,C16:0,和C22:6三种脂肪酸以及氨基酸包括苯丙氨酸,谷氨酸,天门冬氨酸,异亮氨酸,甘氨酸,焦谷氨酸,辅氨酸,亮氨酸和2-氨基己二酸,被筛选出来并被鉴定为生物标记物。结论:扇贝在低温离水呼吸逆向环境的应激下,其无氧呼吸加强,有氧呼吸受到抑制,而这并不是由缺氧所致。此结论意味着在扇贝的半无水活体储藏的条件优化中,氧气补充是一项次要条件。另外,扇贝的能量代谢模式从乳酸作为终产物的通路切换为琥珀酸作为终产物的长期模式也被观测到。渗透条件系统紊乱,氧化损伤,低温应激和神经系统收到扰动也通过数个生物标记物得以发现。3.典型水生脊椎动物麻醉运输血液生理代谢特性的研究目标:检验MS-222在麻醉运输后,并且其在清水中的复苏时间未达到相关法规中记载的最短要求时间的情况下,其MS-222的残留量,以探索通过直接检测MS-222残留来判别复苏时间不足的可能性。通过血浆生化分析初步阐述在麻醉运输并且伴随着复苏过程以后,MS-222对鲫鱼生理活动的影响,并且探索通过血浆生化指标来判别复苏时间不足的可能性。方法:鲫鱼被分为三组,分别进行麻醉运输并且清水中复苏6小时,麻醉运输并且清水中复苏5天以及不麻醉情况下运输的试验。血浆中MS-222含量的检测由高效液相法进行。复苏后的鲫鱼被采集血样并且制备为血浆。血浆生化指标包括肝功能相关的总蛋白,白蛋白,谷丙转氨酶,天门冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶,以及肾功能相关的血肌酐水平,由自动生化分析仪进行测定。结果:所有的血浆样品中MS-222的残留量均低于检测限。对血浆生化指标经过单因素方差分析后,结果为,麻醉运输并复苏6小时的鲫鱼相比不麻醉进行运输的组中总蛋白的含量有统计学显著意义的降低;麻醉运输并复苏6小时的鲫鱼与其他两组相比较,其血肌酐水平有统计学显著的升高。其他数据之间无统计学显著的差异。结论:MS-222在清水复苏的环境下的清除时间远远短于法规所要求的复苏时间,MS-222残留量无法用于复苏时间不足的判别。肌酐含量的变化意味着MS-222会造成可逆的肾功能损害。4.基于非靶向代谢组学技术分析典型水生脊椎动物麻醉生理代谢特性的研究目标:为了不依靠MS-222的残留量来判别复苏时间,基于代谢组学结合支持向量机机器学习方法的判别模型。为了减轻支持向量机模型的固有缺陷,特征选择步骤被用来降低计算负担,并且开发和实现了一种直观呈现分类模型拓扑结构的可视化算法。方法:基于硅烷化衍生化的气相色谱-质谱联用,亲水作用力高效液相色谱-质谱联用和反相高效液相色谱-质谱联用被选用于化学分析。三者的数据在处理后合并以输入至机器模型的训练中。随机森林方法被用于特征选择。交叉验证和测试集样品被用于模型判别性能的验证。自组织投射被用户模型的可视化。recursive feature elimination算法用于潜在生物标记物的筛选,并根据筛选出的生物标记物进行通路分析。结果:从色-质谱联用数据中共挖掘出1971个特征变量,再经过特征选择后维度数量减少到135个。经过grid search方法训练和优化的非线性支持向量机模型其C和γ值分别为0.1574901和0.003100393,其中支持向量数量为37。15个测试样品的分类准确率达到100%。成功实现的可视化算法使支持向量机的拓扑结构能够被直接观察到。筛选并鉴定出了13个生物标记物,基于这些化合物,进行了通路分析。结论:非靶向代谢组学结合机器学习判别经MS-222麻醉运输的鲫鱼复苏时间不足的方法被成功建立。本方法准确可靠,不依赖MS-222的残留进行。进一步的通路分析显示这种预测方法的生物学原理是在麻醉运输的过程中,鳃的损伤造成了气体交换障碍,从而导致了长期的缺氧和高血碳酸症状。同行一些神经系统的影响也被观测到。5.典型水生脊椎动物麻醉运输蛋白质组变化特性的研究目标:为了研究不同方式麻醉运输并且复苏对鲫鱼蛋白质组的影响。进一步确证代谢组学研究中所得结论为可靠性,非标记蛋白质组学被采用。方法:血浆样品被进行了组内的等量混合后,进行了蛋白质提取,并使用超滤管酶解。酶解后的蛋白质使用纳升流速高效液相系统-质谱联用进行肽段检测。所得到的色-质谱联用数据通过Maxquant软件进行了非标定量分析。结果:共鉴定到12251个肽段,以及1353个蛋白质。其中鉴定到的肽段长度要集中在7和11之间,其中长度为10的肽段最多,平均长度为10.9。经过蛋白质定量分析和1.8倍fold change阈值的筛选,其中麻醉运输后6小时复苏时间的样品相对5天复苏时间和非麻醉运输的组分别有22个29个差异蛋白,而后两个组间的差异蛋白为31个。结论:经过通路分析可得知,不同方式麻醉运输并且复苏对鲫鱼能量代谢相关的酶产生了影响。在差异蛋白质中,檬酸合成酶和富马酸水解酶的变化意味着高血碳酸症状,而丙酮酸羟基化酶的变化意味着缺氧应激。蛋白质组学研究的结果与代谢组学的结果相符,代谢组学研究的结果得到了进一步的确证。
[Abstract]:In order to study the survival ability of scallop in semi - dry living storage , the author has made a preliminary study on the survival ability and energy reserve of scallop during storage and transportation of aquatic products . In this paper , the effects of MS - 222 on physiological activities of carp were studied by direct detection of MS - 222 . The results show that the method is accurate and reliable and does not depend on the residual of MS - 222 . The results show that the method is accurate and reliable and does not depend on the residual of MS - 222 .

【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS254.4

【参考文献】