Peroxiredoxin6参与电针预处理脑保护作用及其机制研究

发布时间：2018-03-30 13:09

本文选题：缺血再灌注　切入点：电针　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文

【摘要】：背景缺血性脑卒中严重威胁人类健康，是全球第2大死因，平均每4min就有一人死于中风。其存活者致残率高达90％，造成了巨大的社会和家庭负担。由于病因复杂多变，目前仍缺乏切实有效的干预和治疗措施。氧化应激是参与缺血性脑卒中的病理生理变化的重要机制之一。脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)后，大量的自由基及氧衍生自由基的产生伴随着抗氧化剂的大量消耗。氧化应激能够损伤细胞DNA、蛋白质和细胞膜，导致细胞损伤与死亡。因此，激活抗氧化系统对抗氧化应激损伤是减轻缺血再灌注损伤的重要途径。我们研究发现电针预处理（Electroacupuncture Pretreatment）能够诱导脑缺血耐受，减轻脑缺血再灌注损害。新近研究证实电针预处理能够激活神经细胞内的抗氧化系统，上调硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等物质的表达，减少丙二醛等氧化产物的生成，表明电针预处理的脑保护作用机制与激活抗氧化系统，减轻氧化应激损伤密切相关。我们的研究结果证实，电针预处理可能通过内源性大麻素系统产生脑保护作用，但其调节的下游分子机制有待阐明。研究已证实内源性大麻素系统在中枢神经系统疾病被广泛研究，已被证明是调制众多病理过程，氧化应激就是其中之一。有研究提示内源性大麻素配体2-花生四烯酸甘油（2-arachidonylglycerol,2-AG）可以修改H2O2和ROS刺激引起的胞内Ca2+动员和细胞骨架重排，并可以减少Ca2+诱导的线粒体细胞色素C释放，刺激呼吸链功能，表明内源性大麻素系统可以改善H2O2和ROS造成的氧化应激损伤。2-AG主要作用于内源性大麻素CB1受体，激活下游通路发挥作用。 Peroxiredoxin6(Prdx6)属于抗氧化蛋白超家族Peroxiredoxins（Prdxs），主要分布于细胞质中，是一种新型的抗氧化剂。Prdx6是Prdxs家族唯一使用谷胱甘肽和抗坏血酸作为电子供体的成员，具有除去H2O2和磷脂过氧化氢的能力，并且能够减少磷脂氢过氧化物在质膜的积累。研究表明Prdx6在心脏和肝脏组织的缺血再灌注损伤中具有不可替代的作用，然而Prdx6在脑缺血再灌注损伤中的具体作用尚待阐明。因此本研究为了观察Prdx6的表达在脑缺血再灌注损伤过程中的具体机制，采用大脑中动脉闭塞模型（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）进行实验，并探讨Prdx6在电针预处理发挥脑缺血耐受效应中的机制。实验一电针预处理对脑缺血再灌注后Prdx6表达的影响目的：探讨脑缺血再灌注后Prdx6在缺血半暗带的表达变化，进一步研究经电针预处理脑缺血再灌注后Prdx6的表达变化。方法： SPF级雄性SD大鼠，体重280-320g，采用随机数字法分组。 ①脑缺血再灌注后Prdx6在缺血半暗带的表达变化雄性大鼠22只，分为假手术（sham）组（n=2）和脑缺血再灌注组（n=20）。其中脑缺血再灌注组的20只大鼠再次随机分为五组，即建立MCAO动物模型后，阻断血流时间为2h，于再灌注后的2h，6h，12h，24h和48h分别取脑（n=4），用Western blot方法检测梗死同侧半暗带脑组织中Prdx6表达量的变化。 ②电针预处理对脑缺血再灌注后Prdx6的表达影响雄性大鼠20只，随机分为假手术（sham）组（n=2）、局灶性脑缺血再灌注（MCAO）组、单纯电针（EA）组和电针预处理（EA+MCAO）组(n=6)。单纯电针组只进行电针刺激不制作模型。电针预处理组建立模型前2h给予电针刺激百会穴，30min，频率15/2Hz、强度1-2mA。每组3只进行western blotting检测，另3只行免疫荧光染色。结果：①Western blot结果显示脑组织缺血再灌注后24h Prdx6蛋白在脑组织缺血半暗带表达水平明显升高(P0.05)；②Western blot结果显示再灌后Prdx6蛋白在EA+MCAO组相对于MCAO组明显升高(P0.05)，免疫荧光双标染色结果显示Prdx6蛋白在缺血半暗带的星形胶质细胞有表达，且再灌注后24h Prdx6蛋白显著升高。结论：Prdx6蛋白在脑组织缺血再灌注后24h半暗带表达水平显著升高，并且给予电针预处理后Prdx6的表达进一步升高。实验二Prdx6参与电针预处理脑保护作用的研究目的：探讨电针预处理产生的神经保护作用能否通过下调Prdx6表达而逆转。方法： ①侧脑室注射Prdx6-siRNA并进行效能验证雄性SD大鼠8只，随机分为正常对照组（sham）组（n=2），小RNA干扰（siRNA）组和乱序RNA（scrambled control RNA，scr RNA）组（n=3），其中siRNA组的大鼠均进行侧脑室注射Prdx6-siRNA，而scr RNA组则注射公司提供的scr RNA，注射72h后应用Western blotting方法检测梗死同侧相应半暗带脑组织中Prdx6的表达变化。 ②下调Prdx6表达后大鼠神经功能和形态变化雄性SD大鼠38只，随机分为假手术（sham）组（n=4）、局灶性脑缺血再灌注（MCAO）组、电针预处理（EA+MCAO）组、Prdx6的siRNA干扰（siRNA）组和对照乱序RNA（scr RNA）组(n=8)。siRNA组和scr RNA组在制作模型前3天行侧脑室注射，MCAO模型前2h电针预处理30min。每组大鼠缺血恢复灌注后24h按照盲法原则进行神经行为学评分。每组4只动物进行TTC染色，另4只快速取脑石蜡包埋行TUNEL染色。结果：①Western blotting效能验证:采用侧脑室注射，Prdx6-siRNA能够显著降低Prdx6的表达50%以上（P0.05）。②神经行为学评分:与Sham组相比，其他各组评分均下降。电针预处理后MCAO模型再灌24h（EA+MCAO组）的神经行为学评分明显高于MCAO组。而侧脑室注射Prdx6-siRNA后，相较于EA+MCAO组，神经行为学评分明显降低，逆转了电针预处理产生的缺血耐受作用（P0.05），siRNA组与MCAO组则没有明显统计学差异。③TTC染色和梗死容积：与MCAO组比较，EA+MCAO组大鼠再灌注24h的脑梗死容积百分比明显缩小（P0.01vs.MCAO组）。Prdx6-siRNA组的脑梗死容积百分比则显著高于Sham组和EA+MCAO组（P0.05vs. EA+MCAO组），同时scr RNA组与EA+MCAO组则没有明显的统计学差异，但是与MCAO组相比都有统计学意义（P0.05）。④TUNEL染色：细胞计数结果显示，EA+MCAO组中的TUNEL阳性细胞(53.75±12.34)数量较MCAO组(76.75±14.64, P0.01)明显减少，而siRNA组中的TUNEL阳性细胞(86.25±5.68)数量较EA+MCAO组(P0.01)增高。siRNA组相对于MCAO组，scr RNA组相对于EA+MCAO组都没有明显统计学差异。结论：下调Prdx6表达可以显著逆转电针预处理产生的脑保护作用。实验三Prdx6参与电针预处理抗氧化作用的研究目的：探讨电针预处理是否通过调控Prdx6能够发挥抗氧化作用。方法：雄性SD大鼠60只，，随机分为假手术（sham）组、短暂局灶脑缺血再灌注（MCAO）组、电针预处理（EA+MCAO）组、Prdx6的siRNA干扰（siRNA）组和对照乱序RNA（scr RNA）组(n=12)。其中每组大鼠6只在MCAO模型恢复灌注后24h深麻醉取材提取组织蛋白用ROS，MDA和Nitrotyrosine ELISA试剂盒检测，其余大鼠取材后提取组织DNA用8-OH-dG试剂盒检测，按照试剂盒说明逐一操作。结果：Prdx6-siRNA增加了ROS的产生,升高了MDA,8-OH-dG和NT的水平,从而逆转了电针预处理的保护作用。(P 0.05vs. EA+MCAO组，n=6)。结论：电针预处理通过上调Prdx6从而发挥抗氧化作用。实验四电针预处理通过大麻素CB1R调节Prdx6的研究目的：探讨Prdx6是否通过激活CB1受体依赖途径发挥电针预处理的神经保护作用。方法：SPF级雄性SD大鼠15只，随机分为5组，CB1受体拮抗剂AM251组、SR141716组和CB1激动剂W55212-2组，ACEA组，和溶剂组（n=3）。Sham组、MCAO组、EA组和EA+MCAO组仍采用前面实验的蛋白样品。用CB1受体拮抗剂AM251和SR141716与激动剂W55212-2和ACEA，按照剂量AM251（1mg/kg）、SR141716（1mg/kg）、ACEA（2.5mg/kg）、WIN-55212-2（1.5mg/kg）和溶剂（DMSO,0.6ml/kg）在MCAO模型前半小时腹腔注射给药。再灌注后24h即刻深麻醉大鼠取脑组织缺血半暗带行Western Blotting检测。结果：Western blotting检测结果显示，与MCAO组相比， EA+MCAO组Prdx6蛋白表达水平增高。而与EA+MCAO组相比, AM251组或SR141716组Prdx6表达水平相对较低,溶剂组和EA+MCAO组之间没有区别（P0.05vs. EA+MCAO组）。与MCAO组相比WIN55212-2和ACEA升高了Prdx6的蛋白表达，而溶剂组与MCAO组之间没有统计学差异（P0.05vs. MCAO）。结论：电针预处理能够通过CB1R依赖途径调节Prdx6发挥神经保护作用。小结以上结果表明：Prdx6蛋白在脑组织缺血再灌注后24h半暗带表达水平显著升高，给予电针预处理可以进一步升高Prdx6的表达；电针预处理可以减少脑缺血再灌注后梗死容积，改善神经行为学功能评分并发挥抗氧化作用，然而下调Prdx6表达可以显著逆转电针预处理产生的一系列保护效应，表明Prdx6参与了电针预处理所产生的脑保护作用；进一步研究证实，给予CB1受体拮抗剂可以部分下调EA后Prdx6的表达，而给予CB1受体激动剂则可以模拟电针预处理的作用，说明电针预处理通过内源性大麻素系统CB1受体调节Prdx6产生脑保护作用。综上所述，电针预处理通过上调Prdx6从而发挥脑保护效应，这为EA预处理的抗氧化作用提供了新的机制。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R614

【参考文献】