温控气体损伤建立兔动脉粥样硬化易损斑块模型及CD147-CyPA表达的研究

发布时间：2018-04-02 11:29

本文选题：易损板块　切入点：亲环素A　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：人类在冠心病的诊治方面已获得了许多重大进展,但在世界范围内其致死率及致残率仍极高,特别是急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS),仍然是目前威胁人类健康的重要杀手。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)作为冠心病的主要病理生理基础,其成因极为复杂,和遗传及高脂血症、吸烟、糖尿病、年龄等危险因素密切相关。AS对人类健康的严重危害激起人们极大的努力去探索其发病及进展机制,以求寻找到较好的治疗方法。目前对AS病变进展的认识主要来自各种形式的研究,包括人体病理解剖、以动物模型为基础的细胞生物学研究。对于AS的发病机制,目前有脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌克隆学说等。近年来多数学者支持“内皮损伤反应学说”,认为AS是对内皮细胞受损后的一种慢性反应,在此过程中,氧化修饰的脂蛋白、单核源性巨噬细胞、T淋巴细胞等与动脉壁的正常存在成分相互作用促进了病变的发展。内皮损伤反应学说的核心理念包括：①内皮细胞的慢性损伤,可伴有功能障碍,引起血管通透性增加、单核细胞等黏附以及血栓的形成；②富含胆固醇的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)在血管壁中逐渐蓄积；③脂蛋白的氧化修饰(比如LDL转化为ox-LDL)更加促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展；④血液中单核细胞迁入内膜,进一步转化为巨噬细胞和泡沫细胞；⑤血小板的黏附；⑥激活的细胞(如巨噬细胞、平滑肌细胞等)释放多种因子；⑦内膜中的平滑肌细胞增生,蛋白聚糖及胶原等蓄积；⑧细胞内外脂质的蓄积。组织学研究发现急性冠脉综合征的发生与斑块破裂或侵蚀继发血栓形成,管腔严重狭窄甚至闭塞,从而导致出现急性心肌缺血有关。这类发病人群的病理学切片显示斑块一般具有巨噬细胞源性泡沫细胞浸润、薄的纤维帽和斑块内出血等特征,并从临床实践中得到了证实。为了描述具有破裂倾向的非阻塞性动脉粥样硬化斑块,Muller等于1989年提出了“易损斑块”(vulnerable plaque,VP)的概念,指出此类斑块通常具有较大的脂质核心、薄纤维帽,并且斑块内巨噬细胞浸润。随着研究成果的积累,易损斑块的概念逐渐为学者们所认可,此类斑块由于纤维帽较薄,脂质核心大,在切应力及理化因素的影响下,易出现破裂,破裂后斑块内成分暴露于血液中,易诱发局部血栓形成,造成管腔狭窄严重时可出现急性闭塞,导致血供心肌组织的缺血坏死,增加临床急性心血管事件的发生。从我们目前的认识上来看,充分研究易损斑块可为我们临床治疗提供重要线索,比如何种方法或药物可以用于稳定斑块的治疗等。许多动脉粥样硬化斑块模型包括经典的主动脉球囊拉伤+高脂饮食、单纯高脂饮食、免疫损伤+高脂饮食、基因敲除小鼠模型等,都为我们深入地认识和了解动脉粥样硬化斑块提供了很好的平台,但上述造模方法均不同程度存在操作困难、斑块形态与人类存在差异、价格昂贵等限制因素,所以我们需要建立一种简单易行且形成过程人类相似的实验性动物模型。基于内皮损伤反应学说,我们尝试着利用恒定温度的低温气体损伤血管内皮,结合高脂饮食,尽可能地模拟人类斑块的发生发展,建立一种兔颈动脉粥样硬化易损斑块的动物模型,为研究提供一个更好的平台。 CD147分子又名基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),是一种广泛表达的跨膜糖蛋白,最初是学者在研究肺癌中发现,属于免疫球蛋白超家族的成员。CD147是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的上游调控因子,能够诱导MMPs的产生。在动脉粥样硬化斑块中,巨噬细胞、泡沫细胞、内皮细胞等过度表达的CD147可刺激MMPs过量产生,细胞外基质合成和降解失衡,削弱了斑块纤维帽强度,使斑块易于破裂,在易损斑块的发生及破裂中有重要作用。而亲环素A(Cyclophilin A, CyPA)作为一种氧化应激诱导的分泌因子,对内皮细胞／单核细胞/中性粒细胞等有潜在的趋化作用。Peter Seizer等在研究CD34+组细胞分化进展为泡沫细胞中发现CD147/MT1-MMP/MMP-9表达水平上调,CyPA释放到上清液中促进基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotease9, MMP-9)的分泌,CyPA抑制剂可减少细胞分化过程中MMP-9表达,提示CyPA对MMP-9的表达存在一定的调控。内皮细胞和巨噬细胞表达均可表达CD147和CyPA,二者可能存在相互作用诱导巨噬细胞ERK和核因子-KB信号途径激活导致MMP-9表达水平上升。MMPs特别是MMP-9可降解胶原蛋白和弹力蛋白,削弱斑块纤维帽,增加AS斑块不稳定性。本研究在完成造模的基础上,对斑块内结构进行分析,探讨温控气体损伤+高脂饮食建立兔颈动脉粥样硬化易损斑块的可行性；并利用免疫组织化学染色分析CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9在斑块中表达的分布特点；同时利用ShRNA慢病毒载体转染分离提取的兔外周血单核/巨噬细胞,通过封闭其CD147表达来观察CD147-CyPA在MMP-9产生及CyPA诱导单核/巨噬细胞趋化过程中是否存在相互作用。目的 1、利用持续恒定低温气体损伤内皮,结合高脂饮食建立兔颈动脉粥样硬化易损斑块动物模型,探讨其可行性。 2、分析动脉粥样硬化易损斑块结构形态及CD147、CyPA、MMP-2、MMP-9分布表达特点及血清学指标变化。 3、利用ShRNA'慢病毒载体转染单核/巨噬细胞,通过封闭CD147来观察CD147-CyPA在MMP-9产生及CyPA诱导单核/巨噬细胞趋化过程中是否存在相互作用。方法 1、动物模型的建立：健康纯种雄性新西兰白兔24只,按简单随机方法分为3组,分别为：A组为空白对照组：普通饲料喂养；B组为假手术组：单纯手术损伤操作+高脂饲料喂养；C组为温控气体损伤组：低温气体损伤+高脂饲料喂养。高脂饲料喂养7天后,对C组利用低温气体输出装置对右颈动脉内膜进行损伤,B组给予单纯手术操作,不损伤内膜,术后B组和C组继续高脂饲料喂养12周,A组始终普通饮食。 2、血清学指标：分别于高脂饮食前、高脂饮食13周(实验结束前),通过兔耳中动脉采集外周血,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血脂、CRP、基质金属蛋白酶9、CD147、CyPA等水平。 3、病理组织学切片：14周时处死所有动物,留取石蜡包埋切片及冰冻切片,作HE染色、Masson三色染色、弹力纤维染色及油红0染色；应用RAM11、CD147、 CyPA、MMP-2、MMP-9等单克隆抗体对实验动物血管进行免疫组织化学染色。 4、根据兔源CD147mRNA的序列构建能高效抑制兔外周血单核/巨噬细胞CD147表达的shRNA慢病毒载体,将实验前分离提取的兔外周单核/巨噬细胞分为空白对照组、NC对照组、CD147慢病毒组。对NC对照组及CD147慢病毒组分别给予空白慢病毒、CD147-shRNA慢病毒转染,以荧光显微镜观察转染效果,并检测CD147mRNA及CD147蛋白水平,采用微孔小室趋化实验检测CyPA对单核/巨噬细胞的趋化作用。对三组单核/巨噬细胞分别加入CyPA,孵育24h后ELISA检测上清液中MMP-9含量。 5、统计学分析：数据应用SPSS13.0软件进行统计学描述与分析,计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数总体比较采用One-way ANOVA.方差齐时多个样本均数间的多重比较采用LSD检验。方差不齐时样本均数间的多重比较采用Dunnett'sT3检验。两配对样本均数总体比较时采用配对样本t检验。认为P0.05为差异有统计学意义。结果 1、兔总体生长良好。C组1只新西兰白兔因麻醉过量死亡,B组一只因腹泻死亡,其余动物全部完成实验,所得22只动物数据参与分析。A组8只,B组7只,C组7只。 2、本研究所建立的兔颈动脉粥样硬化易损斑块符合进展期病变特点,纤维帽薄,胶原纤维少,主要为内皮细胞及薄层平滑肌细胞组成,内膜底部存在散在的脂质,部分形成脂质池,脂质池与内皮之间被巨噬细胞及各种来源的泡沫细胞所浸润,部分斑块纤维帽局部可见裂隙,存在散在小血栓形成,证实本模型与人类易损斑块相仿。 3、斑块分析发现斑块内存在大量巨噬细胞,是炎症活跃的主要标志。外膜中可见新生微血管,为炎症细胞进入斑块提供了一条途径。其次纤维帽较薄,为单层内皮细胞及少量平滑肌细胞构成,Masson三色染色显示纤维帽内胶原纤维缺乏,特别是正常血管壁组织和斑块交界处、斑块转角处纤维帽最薄。斑块内存在大的脂质核心,但无胆固醇结晶等,这与造模高脂饮食周期较短有关,且斑块内存在较严重的的粘液样变,使斑块膨胀,增加了斑块的不稳定性。第三,部分内皮细胞脱落,表现为表面侵蚀,可见散在的纤维蛋白聚集,包裹有红细胞、血小板。第四,从HE染色即可看到部分斑块存在裂隙,延伸到斑块深处,局部纤维帽缺损,聚集小量血小板、红细胞、纤维蛋白。第五,严重狭窄病变,此类模型我们考虑与低温气体不但但损伤到了内皮,包括血管中膜平滑肌等深层组织。 4、免疫组化分析空白对照组：血管结构完整,内膜大部分未见巨噬细胞,部分可见散在巨噬细胞,有少量均匀分布的CyPA及CD147表达,未见明显MMP-2/MMP-9表达；中膜无巨噬细胞,未见CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9表达。假手术组：无斑块存在的血管免疫组化与空白对照组相仿；形成的斑块形态较小,为脂纹期改变,斑块内富含巨噬细胞,CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9散在表达；中膜偶有巨噬细胞表达于内弹力板外侧,伴平滑肌排列紊乱。温控气体损伤组：斑块内富含巨噬细胞及巨噬细胞来源的泡沫细胞,CD147与CyPA呈带状分布表达,且具有共区域性,MMP-9与MMP-2在整个斑块内均有分散表达,斑块靠近管腔处表达较多,部分弹力板破裂、溶解,中膜平滑肌细胞与斑块内成分融合,巨噬细胞表达丰富,亦可见CD147、CyPA、MMP-9、MMP-2等表达,无明显规律。 5、血清学指标血清MMP-9检测结果显示：实验前,三组兔血清MMP-9水平无显著性差异(P0.05),第13周末,空白对照组血清MMP-9水平与同组实验前相比,无显著性差异(P0.05)；假手术组组和温控气体损伤组血清MMP-9水平与同组实验前相比,有显著性差异(P0.05),表现为其MMP-9较实验前分别明显升高。假手术组和温控气体损伤组间MMP-9水平有显著性差异(P0.05),表现为后者MMP-9水平明显高于前者。血清CRP检测结果显示：实验前,三组兔血清CRP水平无显著性差异(P0.05),第13周末,空白对照组血清CRP水平与同组实验前相比,无显著性差异(P0.05)；高脂饲料组和低温气体损伤+高脂饮食组血清CRP水平与同组实验前相比,有显著性差异(P0.05),表现为其CRP较实验前分别明显升高。高脂饮食组和恒温气体损伤+高脂饮食组间CRP水平有显著性差异(P0.05),表现为后者CRP水平明显高于前者。血清CD147检测结果显示：实验前,三组兔血清CD147水平无显著性差异(P0.05),第13周末,空白对照组血清CD147水平与同组实验前相比,无显著性差异(P0.05)；高脂饲料组与同组实验前相比略有升高,但差异无统计学意义(P0.05),而低温气体损伤+高脂饮食组血清CD147水平与同组实验前相比,有显著性差异(P0.05),表现为其CD147较实验前分别明显升高。高脂饮食组和恒温气体损伤+高脂饮食组间CD147水平有显著性差异(P0.05),表现为后者CD147水平明显高于前者。血清CyPA检测结果显示：实验前,三组兔血清CyPA水平无显著性差异(P0.05),第13周末,空白对照组血清CyPA水平与同组实验前相比,无显著性差异(P0.05)；高脂饲料组与同组实验前相比略有升高,但差异无统计学意义(P0.05),而低温气体损伤+高脂饮食组血清CyPA水平与同组实验前相比,有显著性差异(P0.05),表现为其CyPA较实验前分别明显升高。高脂饮食组和恒温气体损伤+高脂饮食组间CyPA水平有显著性差异(PO.05),表现为后者CyPA水平明显高于前者。血脂变化：TC、TG、LDL等指标B组与C组13周末较高脂饮食前相比明显升高,差异有统计学意义(P0.05),空白对照组前后对比差异无统计学意义(P0.05)。 6、CD147慢病毒组单核/巨噬细胞CD147表达水平较其他两组明显降低(P0.01),基因沉默CD147降低了CyPA对单核/巨噬细胞的趋化作用(P0.05)及CyPA诱导的MMP-9(P0.05)产生。结论 1.我们采用的恒温气体连续刺激损伤内皮结合高脂饮食的方法可有效建立兔颈动脉粥样硬化易损斑块,形态分析符合进展性动脉粥样硬化病变,与人类易损斑块相仿。 2.易损斑块内CD147与CyPA分布具有共区域性,CyPA可能在MMPs产生中起到促进作用；在易损斑块中可见大量巨噬细胞及泡沫细胞聚集,MMP-9与MMP-2表达明显增多。 3. CyPA对单核／巨噬细胞趋化作用依赖或部分依赖于膜CD147水平,阻断CyPA-CD147相互作用可显著降低单核／巨噬细胞MMP-9表达水平。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5

【参考文献】